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/00-author.Rmd:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | # 作者简介 {#author .unnumbered}
 2 | 
 3 | * [我的博客](http://www.bio-info-trainee.com/)
 4 | * [我们的论坛](http://www.biotrainee.com/forum.php)
 5 | * [捐赠我](http://www.bio-info-trainee.com/donate)
 6 | 
 7 | #### 编者-曾健明 {-}
 8 | 
 9 | 生信菜鸟团博客博主,同时也是生信技能树创始人。
10 | 
11 | 工作经历：CAFS-->sustc-->Lilly-->universityof Macau（表观遗传学方向）
12 | 
13 | 生信技能：WES/RNA-seq/CHIP-seq的相关数据处理流程搭建及项目实战；大型服务器的安装与维护；生物信息数据处理环境搭建；简单数据处理网页工具制作。
14 | 
15 | 作为菜鸟团博主和论坛创始人，最初与大家分享自己的生信的学习笔记及心得体会。促进生信的学习和交流，构建出完整的生物技能树。搭建生信技术人员联盟，从入门到进阶帮助到每一位生信人。
16 | 
17 | 最期待看到团队成员的成长，以及论坛稳健发展和各版块完善。带领团队和论坛成员完善生信技能树的同时，自己也收获前所未有的锻炼，希望自己不忘初心。
18 |  
19 | #### 编者-赵飞 {-}
20 | 
21 | 中科院上海植物生理生态研究所硕博连读二年级，主要方向为生物信息与植物表观遗传。目前任生信技能树公众号编辑，正在努力学习各种数据分析所需技能。
22 | 
23 | 喜欢分享和交流，曾著有《靠谱学长说:聊聊考研复习这件事》文集!
24 | 
25 | 生信技能：Linux系统使用，shell和R的基础编程，简单数据库网站开发，转录组学(lncRNA/small RNA)数据分析.
26 | 
27 | 希望和大家共同进步，共同成长。
28 | 
29 | #### 编者-曹换换 {-}
30 | 
31 | 天津大学精仪学院硕士，生物信息方向（肿瘤）。
32 | 
33 | 一个活脱脱的理想主义者！
34 | 
35 | 生信技能：生信入门阶段，常用语言R语言。Linux系统的安装，使用初级。简单的python语言使用。
36 | 
37 | 希望有更多的人参与生信技能树，无私分享！做大做强！
38 | 
39 | 其实我立志想做美少女生信讲师~~~哈哈哈哈哈哈~~~要不然健美操白跳了
40 | 
41 | 
42 | #### 编者-徐洲更 {-}
43 | 
44 | 中科院上海植物生理生态研究所硕博连读生，主要方向为植物遗传学和生物信息学。  
45 | 
46 | 喜欢写作，在简书，生信技能树公众号，生信媛公众号都可以看到我的文章哟。
47 | 
48 | 生信技能：熟练掌握Linux基本操作，擅长用R编程，基于Python进行网页开发，转录组学(mRNA)数据分析，重测序遗传定位
49 | 
50 | 生命不息，折腾不止
51 | 
52 | #### 编者-覃千山 {-}
53 | 
54 | 本科毕业于东北林业大学，硕士毕业于中国农业科学院。现已在苏州工作两年。
55 | 
56 | 生信技能：宏基因组分析，NGS流程搭建，引物设计；熟练python、R、linux，会点网页，会点latex
57 | 
58 | 铁汉1990和sam's note的博主。尝试，总结，分享，不断成长，不断创造。
59 | 
60 | #### 团队-生信菜鸟团公众号  {-}
61 | 
62 | ![生信菜鸟团公众号二维码](http://www.bio-info-trainee.com/wp-content/uploads/2017/03/1505528391.png) 
63 | 
64 | 
65 | #### 团队-生信技能树公众号  {-}
66 | 
67 | ![生信技能树公众号二维码](http://www.bio-info-trainee.com/wp-content/uploads/2017/03/1505525834.png) 
68 | 
69 | 
70 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/01-sequencing.Rmd:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | \mainmatter
  2 | 
  3 | # 数据产生 {#sequencing}
  4 | 
  5 | 做软件开发和建模的毕竟是少数，大部分人进入生物信息学领域的第一步就是数据处理，有经验的分析者各种各样的数据都会遇到，本章节会一一谈到。 
  6 | 
  7 | 其中大部分生物信息学相关数据都会由全世界各地的科研工作者上传到GEO数据库，包括各种芯片数据及针对各种物种的测序数据，它们的[样本数排序](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/browse/?view=platforms&display=20&zsort=samples)如下：
  8 | 
  9 | ![平台流行程度](image/C1/GEO_platform_top50.png)
 10 | 
 11 | 由上表可以看出，到目前为止（2017年）**累积应用**最广泛仍然是mRNA的表达谱检测芯片，以affymetrix的 Human Genome U133 Plus 2.0 Array和illumina的HumanHT-12 V4.0 expression beadchip为代表。
 12 | 高通量测序作为后起之秀已经逐渐在超过芯片数据样本量了，而且高通量测序几乎都是illumina的测序仪产出的，包括HiSeq 2000/2500，nextSeq500,MiSeq等等。虽然HiSeq X10并没有排在前面，原因其实是GEO公布的数据与现实有两到三年的时差，因为测序数据需要发表文章之后才会公布，而且可以设置一到两年的释放期限。
 13 | 
 14 | 值得一提的是HiSeq X10作为目前通量最高的测序仪，其大多测的是人类癌症病人相关数据，而这些数据因为隐私问题，很多都是不予公开的，需要注册申请才能下载。
 15 | 
 16 | 下面我们就GEO里面存放的数据进行分门别类的介绍，分首先是芯片数据，包括各种生物学应用的芯片，然后是高通量测序数据，包括二代三代测序数据。
 17 | 
 18 | ## 芯片技术
 19 | 
 20 | > 早期的生物信息学数据都是由芯片产生，2001年做两百多个mRNA表达谱芯片数据分析都可以发nature，虽然现在逐渐被NGS替代了，但是成本方面却还是它们的优点，所以仍然会有不少科研项目选择芯片来检测样本。
 21 | 
 22 | 这样，做生物信息学数据分析的我们还是得掌握它们的基本分类，历史，以及处理方法。而且已经发表的芯片数据量非常庞大，在里面进行一些探索性挖掘也会有意想不到的收获。当然，前提是要下功夫了解芯片，学习它们。
 23 | 
 24 | ### 三大芯片制造商
 25 | 
 26 | > 在GEO数据库里面查看GPL信息，就可以看到芯片厂商出品的数据排名，基本上就是 affymetrix , illumina , agilent 这3家公司为主。
 27 | 
 28 | #### Affymetrix {-}
 29 | 
 30 | 昂飞（Affymetrix）公司，基因芯片行业的先驱，全球销量第一的基因芯片厂家。它是第一款商业化基因芯片的诞生之地，它是全球基因芯片行业标准的制定者。
 31 | 
 32 | 上个世纪八十年代，Stephen P.A. Fodor博士与他的科学家团队将组合化学技术与半导体制造技术结合，尝试在小玻璃芯片上建立大量生物数据。这一革命性的想法经过他们十多年的钻研尝试，成为了现实——他们发明出革命性的基因芯片GeneChip®技术。这一技术迅速进行商业转化，由Affymax公司的Affymetrix部门专职运营。
 33 | 
 34 | 1992年，Stephen P.A. Fodor博士带领Affymetrix部门从Affymax公司独立出来，在硅谷中心单独成立公司，名字仍采用Affymetrix，也就是现在的Affymetrix公司。公司最初的发展受到美国政府先进技术计划项目的经费支持，而公司也没辜负联邦政府的期望，1994年就开始将GeneChip®专利技术进行商业化运营，并于1996年在纳斯达克上市。Affymetrix以基因芯片为立家之本，陆续收购包括分子生物学试剂USB、免疫学试剂公司eBioscience等多家生物医学公司，形成了环绕基因组学和蛋白组学的庞大产品生态群。
 35 | 
 36 | Affymetrix公司致力于研发能够在细胞、蛋白和基因水平对生物系统进行多重和平行分析的技术，促进科研人员研究成果的转化，使科学家和临床医生能够将其研究成果更快地转化为对疾病的治疗技术，并在农业领域促进基因标记辅助育种技术的发展。
 37 | 
 38 | Affymetrix公司的客户遍布于生物学科研工作的各个领域，包括生物制药、临床诊断、农业育种、食品安全和消费品行业，同时还包括科研院所、政府实验室和其他非盈利性研究机构等。
 39 | 
 40 | Affymetrix公司曾入围全球50个最具创新能力公司和2011年度Frost & Sullivan北美产品领袖奖。公司于1996年在美国纳斯达克(NASDAQ)上市，总市值超过30亿美元，20年来，凭借在美国股票市场上的融资，Affymetrix公司在企业并购的路上一路狂奔。
 41 | 
 42 | ```
 43 | 2000年2月，Affymetrix 收购了DNA芯片仪器公司Genetic MicroSystems；
 44 | 2000年10月，Affymetrix收购了计算基因组学公司Neomorphic；
 45 | 2005年，Affymetrix收购了基因研究公司 ParAllele BioScience，随后又收购了分子生物学和生物化学试剂产品公司USB及膜蛋白提取纯化产品公司Anatrace；
 46 | 2008年，Affymetrix收购了基因标记公司True Materials 和芯片公司Panomics；
 47 | 2012年，收购了免疫肿瘤研究和诊断公司eBioscience。
 48 | ```
 49 | 
 50 | 然而，Affymetrix公司也逃不过被并购的命运。在2016年1月9日，全球最大的科学仪器生产商赛默飞世尔科技公司表示，同意13亿美元现金收购美国芯片制造商Affymetrix，以加强其基因分析产品相关业务。
 51 | 
 52 | 在GEO数据库里面，[Affymetrix芯片的样本排序是](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/browse/?view=platforms&search=Affymetrix&display=20&zsort=samples)：
 53 | 
 54 | ![Affymetrix芯片排序](image/C1/GEO_Affymetrix_top50.png)
 55 | 
 56 | #### Illumina  {-}
 57 | 
 58 | > Illumina总部位于美国加州圣地哥。它们的二代测序技术太出名以至于掩盖掉了其芯片产品的关辉，在GEO数据库可以查到它们的芯片科研市场占有率也不可小觑。
 59 | Illumina的核心技术是光纤微珠芯片平台和Solexa测序平台，广泛应用于基因组学研究。
 60 | 其新一代激光共聚焦光纤微珠芯片技术，具有高密度，高灵敏度，高重复性，定制灵活等特点。
 61 | 该平台主要应用于功能基因组学基因表达的研究和SNP基因分型研究，可高精度地对数千甚至数万个SNP位点及基因表达谱、LOH、染色体片段重复等进行检测和分析。
 62 | 
 63 | 芯片优点有：
 64 | 
 65 | ```
 66 | •杂交效率高-每个微珠连有约80万条同种探针，加之微珠的空间效应，杂交效率高。
 67 | •数据质量高-每个珠子在芯片上随机分布，且高达15~30倍重复，数据质量高。
 68 | •完全的质控-独特的解码技术，使得每个珠子每种探针都能得到质控。
 69 | •良好的重复性-芯片具有良好的重复性，相关系数R2大于0.99。
 70 | •高灵敏度低上样量-低至ng级的核酸样本就即可有效检测。
 71 | •定制灵活-可根据不同使用者研究需求量身打造芯片产品。
 72 | •广泛的应用范围-光纤微珠芯片广泛应用于SNP基因分型研究、基因表达的研究和甲基化研究。
 73 | ```
 74 | 
 75 | 在GEO数据库里面，[Illumina芯片的样本排序是](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/browse/?view=platforms&search=Illumina&display=20&zsort=samples)：
 76 | 
 77 | ![Illumina芯片排序](image/C1/GEO_Illumina_top50.png)
 78 | 
 79 | 
 80 | 不得不提的是Illumina公司的产品线除了上面提讲解的通量生物芯片，更为流行的其实是高通量测序仪，当然，还有少量定量PCR仪。
 81 | 
 82 | 高通量生物芯片技术是Illumina公司成长的第一个里程碑，在人类基因组计划完成后，生命科学研究进入后基因组时代，对于SNP的研究成了基因功能研究的主要技术手段，国际上也有了专门针对SNP研究的Hapmap计划，而Illumina公司的高通量芯片称为Hapmap计划的主要技术平台，所有Hapmap的数据，80％以上都来自于Illumina的高通量芯片平台，全世界科学家选择Illumina芯片平台的主要原因也在于此。
 83 | 
 84 | 高通量测序仪可谓是Illumina最大的产品线，高通量测序技术的出现和发展可以说是近五年时间内生命科学领域最具有革命性发展的技术之一，它极大的加速了整个科学研究的进程，也改变了应用领域和临床研究及诊断的思路。目前，公司主打产品有MiSeq测序仪、HiSeq X Ten测序仪、Miseq FGx测序仪、NextSeq 500/550桌上型测序仪、MiniSeq台式测序仪等等。
 85 | 
 86 | 定量PCR仪Eco，是Illumina公司在2010年收购另外一个定量PCR仪厂家而扩增的产品线。定量PCR仪是目前分子生物学实验中常用的核苷酸检测设备，已经被广泛应用于生命科学领域的各个方面，包括新药开发研究、药物疗效研究、药物预后指标研究等等。
 87 | 
 88 | #### agilent {-}
 89 | 
 90 | Agilent的生物芯片（系统）和别的公司的生物芯片（系统）一样，同样由：扫描仪、生物芯片、分析软件，三部分组成。
 91 | 
 92 | Agilent的芯片扫描仪，叫SureScan DX。SureScan DX已经取得了欧洲的CE认证，和中国的CFDA认证，可以应用于临床。
 93 | 
 94 | Agilent的CGH生物芯片，在细胞遗传学中有着很广泛的接受度，并可以临床应用。
 95 | Agilent的表达谱芯片，是用荧光素直接标记的，检测灵敏度高、检测速度快、检测的线性范围大，很受欢迎。另外比较受欢迎的就是Agilent的miRNA相关芯片了。
 96 | 
 97 | 在GEO数据库里面，[Agilent芯片的样本排序是](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/browse/?view=platforms&search=agilent&display=20&zsort=samples)：
 98 | 
 99 | ![Agilent芯片排序](image/C1/GEO_Agilent_top50.png)
100 | 
101 | 
102 | 
103 | ### 表达谱芯片
104 | 
105 | > 最初的芯片就是为了检测mRNA的表达量而设计开发的，而affymetrix就是其中的佼佼者。
106 | 
107 | 表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核苷酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片.
108 | 待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA，并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，
109 | 再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。
110 | 用于研究基因表达的芯片可以有两种：① cDNA芯片；② 寡核苷酸芯片。
111 | 
112 | 
113 | 早期的表达谱芯片主要是Affymetrix公司的hgu系列，包括95,133 出货量最大的应该是**hgu133plus2系列**了，如下
114 | 
115 | ![](image/C1/affymetrix-133plus2-array.png)
116 | 
117 | 统称为旧版的affymetrix芯片，用R语言的affy包即可读取进行数据处理，我曾经写过教程：[用affy包读取affymetix的基因表达芯片数据-CEL格式数据](http://www.bio-info-trainee.com/1580.html) 就是下面的代码：
118 | 
119 | ```
120 | ## 把所有的cel文件都放在一个文件夹(比如/home/jmzeng/your/celfiles文件夹)下面，文件夹地址赋给变量 dir_cels
121 | dir_cels='/home/jmzeng/your/celfiles'
122 | library(affy)
123 | #perform mas5 normalization
124 | affy_data = ReadAffy(celfile.path=dir_cels)
125 | eset.mas5 = mas5(affy_data)
126 | exprSet.nologs = exprs(eset.mas5)
127 | exprSet = log(exprSet.nologs, 2)  #transform to Log_2 if needed
128 | ### 上面是是mas5)，下面是rma，两种不同的芯片数据处理方法，最后都是要生成表达矩阵。
129 | library(affy)
130 | data <- ReadAffy(celfile.path=dir_cels) 
131 | eset <- rma(data)
132 | write.exprs(eset,file="data.txt")
133 | ```
134 | 
135 | 还有新版的表达谱芯片，比如Human Gene 1.0 St Array  
136 | 
137 | ![](image/C1/affymetrix-2.0ST-array.png)
138 | 
139 | 用R语言的oligo包来进行数据处理，我曾经写过教程：[用oligo包来读取affymetix的基因表达芯片数据-CEL格式数据](http://www.bio-info-trainee.com/1586.html)，把芯片数据转换为表达矩阵的核心代码如下：
140 | 
141 | ```
142 | library(oligo)
143 | celFiles <- list.celfiles()
144 | affyRaw <- read.celfiles(celFiles)
145 | library(pd.mogene.2.0.st)  
146 | ## 根据芯片平台来载入芯片设计包，没办法自动选择
147 | ## 不同的芯片探针包不一样：mogene20sttranscriptcluster.db
148 | eset <- rma(affyRaw)
149 | write.exprs(eset,file="data.txt")
150 | ```
151 | 
152 | affymetrix还开发了**更新版**的表达谱检测芯片，比如针对人类的HST2.0，据文献报道其很多方面都优于转录组测序，这款芯片设计比较复杂，如下：
153 | 
154 | ![](image/C1/affymetrix-human2.0ST-characterization.png)
155 | 
156 | 不过，illumina的表达谱芯片也是非常出名的，比如Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip。 
157 | 
158 | 需要用R包lumi来处理illumina的bead系列表达芯片，[见我博客教程](用lumi包来处理illumina的bead系列表达芯片)
159 | 
160 | 上述表达谱芯片在GEO里面的代表性数据有：
161 | 
162 | | GEO地址                                    | 数据描述                                     |
163 | | ---------------------------------------- | ---------------------------------------- |
164 | | [GSE11072](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE11072) | 2009-gastric cancer SBC Human 16K cDNA Microarray |
165 | | [GSE42872](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE42872) | 2015-melanoma-vemurafenib HuGene-1_0-st  |
166 | | [GSE2467](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE24673) | 2015-hub-gene-mcode-retinoblastoma  HuGene-1_0-st |
167 | | [GSE22863](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE22863) | 2011-NSCLC HuGene-1_0-st                 |
168 | | GSE622221, GSE4180414, GSE5140122        | A total of 117 samples (54 cases and 63 controls) Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array  2015-HCC |
169 | | [GSE21815](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE21815) | 2016-CRC Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K |
170 | 
171 | 公布这些数据的文章里面都有对这些数据处理的方法的详细描述，以及对应的分析结果。
172 | 
173 | 
174 | ### 基因分型芯片
175 | 
176 | > 在人类基因组中，基因变异以许多不同的形式存在，包括体细胞突变、单核苷酸多态性（SNP）、拷贝数变异（CNV）和结构改变（插入缺失，Indel）。研究这些变异需要强大的基因分型工具。
177 | 其中最出名就是Affymetrix的SNP6.0芯片以及illumina的OMIN系列，下面是详细介绍：
178 | 
179 | 
180 | 一、基于GeneChip平台的基因分型芯片
181 | 
182 | * 芯片推荐： Genome-Wide Human SNP Array 6.0
183 | * 芯片介绍： Affymetrix Genome-Wide Human SNP 6.0芯片产品涵盖超过1,800,000个遗传变异标志物：包括超过906,600个SNP和超过946,000个用于检测拷贝数变化（CNV, Copy Number Variation）的探针。
184 | 
185 | 
186 | * 芯片推荐：DMET™ Plus
187 | * 芯片介绍：人类基因组上的差异（SNP、插入、缺失、复制等）会导致不同个体对同一药物产生不同的反应。针对这种情况，Affymetrix推出了DMET（Drug-MetabolizingEnzymes and Transporters）Plus完整解决方案。它能检测225个基因中与药物代谢和转运有关的1936个分子标记。这些分子标记已经在不同种族、至少1200个个体中验证。通过检验不同个体分子标记的差异，研究者们可以发现药物发挥不同作用的遗传机制，从而决定药物的剂量和使用对象。
188 | 
189 | 二、基于GeneTitan平台的Axiom®基因分型芯片
190 | 
191 | Axiom®基因分型解决方案为您提供多种芯片。您可以选择要研究物种的自定义内容，也可以选择来自Axiom®基因组数据库的基因型经过验证的内容。
192 | 
193 | 芯片推荐：Infinium OmniZhongHua-8 Kit
194 | 
195 | 覆盖了中国人特有常见和稀有变异，是第一款人类种群特异的全基因组芯片。经过优化的标签SNP内容来自HapMap所有三个阶段以及千人基因组计划（1kGP），可用于在中国人种群中探索全新的疾病和性状关联。特别覆盖中国人81%的常见变异（MAF>5%）和60%的稀有变异（MAF> 2.5%），适合全基因组关联研究（GWAS）。采用Illumina专利的BeadArrayTM技术，可提供非常高的数据质量，平均检出率>99%，重复率>99.9%。
196 | 
197 | illumina的Omni系列芯片经过了许多年的市场迭代，能检测的位点也越来越多，下面是它的一个简单的汇总表格。
198 |  
199 | ![illumina的Omni系列芯片进化史](image/C1/illumina_omni_array_list.png)
200 | 
201 | 参考：https://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_gwas_roadmap.pdf
202 | 
203 | ### CNV芯片
204 | 
205 | > 拷贝数变异（CNV）是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1 kb 以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复。
206 | CNV 是基因组结构变异 ( SV ) 的重要组成部分。CNV 位点的突变率远高于SNP，是人类疾病的重要致病因素之一。
207 | 大量研究表明，尤其是肿瘤，与拷贝数变异密切先关。
208 | 
209 | 能检测CNV的手段主要有：全基因组测序、生物芯片、CNVseq、CNVplex、AccuCopy、质谱法、Taqman法。
210 | 
211 | #### Affymetrix SNP6.0 array  {-}
212 | 
213 | 其中最出名的要属Affymetrix SNP6.0 array这款芯片 ，在TCGA计划和CCLE里面都有。芯片特有超过180万个遗传变异标记，包括单核苷酸多态性（SNP）以及拷贝数变异（CNV）。对CCLE数据库可以做的分析非常多，强烈建议初学者花时间好好了解一下，[我博客也写过教程](http://www.bio-info-trainee.com/1327.html)
214 |  
215 | 值得一提的是拷贝数变异的检测目前是以芯片技术为标准，NGS技术仍然是落后于芯片技术，在这一点上面。对于Affymetrix SNP6.0 array这款芯片得到也是CEL文件的原始数据，可以走PICNIC软件的流程来进行分析，得到最后的拷贝数变异的片段。
216 | 
217 | #### affymetrix公司的OncoScan平台 {-}
218 | 
219 | > 使用Affymetrix OncoScan FFPE芯片对肿瘤相关样品(包括cfDNA与FFPE样本)进行试验与数据分析，并通过OncoScan 3.01软件找到与临床相关的拷贝数变异（CNV）和杂合性缺失（LOH）。
220 | 
221 | 
222 | 突破性的技术：在短短48小时内完成全基因组范围的实体瘤拷贝数分析，仅需80ng起始DNA。
223 | 全新的OncoScan FFPE芯片利用Affymetrix独特的分子倒置探针（MIP）技术，能够快速经济地分析来自FFPE样本的少量的高度降解的DNA，让实体瘤癌症分析向前迈进了一大步。
224 | 这一新产品在一次实验中即可提供全基因组范围的拷贝数数据，且在全基因组内大约900个已知的癌基因、杂合性缺失（LOH）上的分辨率极高，同时可以提供临床相关的获得性突变的数据。在分析软件方面，研发人员升级了早一代的BioDiscovery Nexus软件，增加了许多转为癌症分析设计的功能，命名为OncoScan™ Nexus Express软件，它实现了几分钟内数百个样本的拷贝数分析能力，也将随产品免费提供。
225 | 此项技术之前是通过Affymetrix研究服务实验室的OncoScan™ Express 2.0服务来提供的，展现出空前的成功率，在过去两年已有70多篇文章发表。该平台实现了高度降解样本的DNA检测，从保存了十年或以上的FFPE样本中挖掘出丰富的信息。
226 | 
227 | 目前Affymetrix的OncoScan在GEO平台的地址是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL18602
228 | 
229 | | Status          | Public on Apr 23, 2014                   |
230 | | --------------- | ---------------------------------------- |
231 | | Title           | [OncoScan] Affymetrix OncoScan FFPE Assay |
232 | | Technology type | in situ oligonucleotide                  |
233 | | Distribution    | commercial                               |
234 | | Organism        | [Homo sapiens](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=9606) |
235 | | Manufacturer    | Affymetrix                               |
236 | 
237 | 截止到目前(2017年09月07日)仅有22个实验数据，共355个样本的公共数据被上传。是非常新的平台
238 | 
239 | 
240 | ### 甲基化芯片
241 | 
242 | > DNA甲基化对基因表达调控起着重要作用，而且这种调控作用可以随着细胞分裂在世代间稳定遗传。
243 | 甲基化多发生于胞嘧啶位置，在细胞和组织分化、发育、衰老、疾病发生以及适应环境等过程中，甲基化状态可能随时发生变化。
244 | 非正常的DNA甲基化及其导致的基因表达往往与疾病相关联，例如肿瘤、精神性疾病、X-染色体沉默、自身免疫疾病等。
245 | 
246 | DNA甲基化已成为当前分子生物学的研究热点之一。而芯片是探索DNA甲基化程度的一大利器，在通量，覆盖度，性价比方面都优于二代测序技术。
247 | 且主要由illumina公司生产，产品进化路线是 27k --> 450K --> 850K。 
248 | 在TCGA计划的早期使用过不少27K的芯片，但是其覆盖位点太少，中后期全面转向为450K，同时也是GEO数据库里面被发表最多的甲基化芯片数据。
249 | 
250 | 下面着重介绍一下最新款的IlluminaInfinium Methylation EPICBeadChip（850K）
251 | 
252 | 该款芯片全面覆盖表观基因组的关联研究，可以基于单核苷酸分辨率定量检测基因组中的甲基化位点，主要优势如下
253 | 
254 | * ``高通量的定量检测``：可同时检测>850,000个位点；
255 | * ``全面的全基因组覆盖范围``：覆盖>95%的CpG岛，99%的RefSeq基因，保留了>90%的450K甲基化位点；
256 | * ``覆盖了增强子区域``：在增强子区域新增了350,000个甲基化位点（包括ENCODEenhancers，ENCODEopenchromatin，>80% ofFANTOM5 Enhancers，GENCODEgenes，promoters，UTRs）；
257 | * ``分辨率高``：单碱基分辨率，可以直接检测到发生甲基化的准确位点；
258 | * ``可重复性高``：技术重复的重现性>98%，与450K芯片的重复性>98%；
259 | * ``DNA起始量低``：仅需250ng，相比于450K芯片的1ug DNA，大大节约了样品量；
260 | * ``高质量的实验数据``：使用Infinium技术，无其它甲基化DNA捕获方法常有的偏向性，同时采用Infinium I和Infinium II探针设计，进一步保证高质量的实验数据；
261 | * ``兼容FFPE样本``，支持LIMS及自动化系统。
262 | 
263 | 一个基因会设计多个探针，尤其是结构复杂的基因，一般会在启动子区域，utr区域，外显子，内含子等genebody上面设计探针，如果想把探针ID对应到具体的基因的具体区域，需要去其芯片官网找**manifest文件**。
264 | 
265 | ### miRNA芯片
266 | 
267 | > microRNA(microRNA)是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。通过与靶基因的3’UTR配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译，从而抑制靶基因的表达。
268 | 
269 | 现在，miRBase共收录223个物种的28645个microRNA前体，35828个成熟microRNA (miRBase, v21, 2014年6月)。这些数据可以在它的[官网](ftp://mirbase.org/pub/mirbase/21/)直接下载.
270 | 
271 | 为miRNA研究设计芯片的主要是Agilent公司，比较成熟的产品是Agilent microRNA芯片（V21.0）产品信息
272 | 
273 | | pecies|Name| P/N  |Design ID | Format  |
274 | | -----|:-------------:| -----:| :-------------:| -----:| 
275 | | Human| SurePrint G3 Human miRNA Microarray, Release 21 |  G4872A| 070156| 8 x 60K  |
276 | | Mouse|SurePrint G3 Mouse miRNA Microarray, Release 21 |G4872A|070155| 8 x 60K  |
277 | | Rat| SurePrint Rat miRNA Microarray, Release 21|  G4471A|070154| 8 x 15K  | 
278 |   
279 |   
280 | 
281 | ## 二代测序技术
282 | 
283 | >又称下一代测序，就是NGS啦
284 | 
285 | 2005年454公司的 Genome Sequencer 20 System，2006年illumina公司的Solexa和2007年ABI公司的SOLiD标志着第二代测序技术的诞生。
286 | 之后陆续在2006年推出454 FLX系统、2010年推出illumina HiSeq系统和同年推出的基于半导体芯片测序技术的Ion PGM已经陆续成为当前基因测序的中坚力量。
287 | 
288 | ### NGS先行者：454及其序列数据
289 | 
290 | 说到二代测序，454公司可谓是不折不扣的吃螃蟹的人。早在2005年，454就推出了第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这也是NGS领域的第一台测序仪。随后，454被罗氏收购，并在2006年推出了名动测序界的GS FLX测序系统。
291 | 
292 | 454的技术核心在于乳液PCR和焦磷酸测序法，该技术能获得较长的序列，平均读长可达400 bp；相对于illumina平台其主要缺点是无法准确测定单碱基重复序列的长度。
293 | 
294 | 454 GS-FLX测序仪产生的序列文件格式为SFF (Standard Flowgram Format)，是一种二进制文件。虽然目前有很多软件可以直接读取SFF格式文件进行分析，但更多的软件还是需要把SFF格式转换为Fna-Qual格式，这种格式把序列和与序列对应的碱基质量分别放在以Fna和Qual为后缀的文件里(文本文件)。
295 | 
296 | ①.fna数据文件保存碱基序列   
297 | 
298 | ```
299 | >HKSD5CR01D6P3Ilength=70 xy=1599_2828 region=1 run=R_2012_03_15_01_23_26_GGAGTAGCATGCGTGACGAATCGTAGTTCCGACCATAACGATGCCGACCTTTGACCA
300 | ```
301 | 
302 | ②qual数据文件保存碱基质量值
303 | ```
304 | >HKSD5CR01D6P3Ilength=70 xy=1599_2828 region=1 run=R_2012_03_15_01_23_26_40 40 40 40 40 40 4040 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 39 39 39 40 40 40 34 34 34 34 40 30 3030 40 39 39 39 38 38 37 40 40 38 38 32 24 17 17 20 20 26 30 30 36 36 37
305 | ```
306 | 
307 | 随着测序成本的不断降低，尽管读长偏长，但成本过于昂贵的454测序技术逐渐退出了科研界。
308 | 然而，虽然454的生命科学测序业务早已关停，454带来的影响却仍不容磨灭。
309 | 来自众多大型科研项目（例如人类微生物组计划）中的海量454序列信息，仍是当今研究中不可或缺的重要参考数据和引用来源。
310 | 
311 | ### 渐行渐远：SOLiD及其序列数据
312 | 
313 | 再来谈谈几乎快被遗忘的ABI公司。事实上，在454和illumina走入市场之前，ABI一直处理测序市场上傲视群雄的霸主地位。
314 | 在454和illumina初亮相后，由于SOLiD系统采用的是连接法而非PCR反应，因此对于高GC含量的样本具有非常大的优势。
315 | 然而，后续SOLiD系统通量难以提升，且读长短、成本高，也已慢慢退出历史舞台。
316 | 
317 | SOLiD技术，其主要核心是油包水PCR和基于“双碱基编码原理”连接测序法。
318 | 该技术主要优势在于每个位置的碱基均被检测两次，测序准确性高达99.9999%，算是第二代测序技术中准确性最高的。
319 | 但是该技术的读长仅为2X50 bp，后续序列拼接等比较复杂，且由于是双碱基对应一个荧光信号，一旦发生错误，容易在荧光解码阶段产生连锁错误。
320 | 
321 | SOLiD技术的原始数据格式是csfasta及与其匹配的qual，可以利用[python脚本](http://edison.cremag.org/resources/seq-analysis/tools/solid2fastq/solid2fastq.py)或者[perl脚本](http://www.bbmriwiki.nl/svn/bwa_45_patched/solid2fastq.pl)
322 | 将其转为csfastq(color space fastq)，与fastq格式一致，四行记录一碱基序列，区别在于第二行不是碱基序列，而是color的编码，如下：
323 | 
324 | ```
325 | @SRR2967009.1 100_1000_1168_F3
326 | T10011023211201220121202030102221012302121010131001
327 | +
328 | 2@@@@>@?@@@@<@@//;@@/@9?@8@=@@@6;6@66;<@6@67?2?;/@
329 | ```
330 | 
331 | colorspace编码规则为：
332 | 
333 | 虽然csfastq与目前流行的fastq格式记录的测序序列不同，但是csfastq文件也可作为fastqc的输入文件进行质控,并可利用多款软件进行后续分析，如SHRiMP、Sequel、BFAST和Bowtie等等。
334 |  
335 | ### 一家独大：illumina及其数据
336 | 
337 | illumina在NGS乃至整个测序市场中的霸主地位已毋庸置疑。引用illumina官方说法：“世界上90%以上的测序数据都由Illumina仪器产生”，不较真的话，这句话确实在某种程度上反应了illumina雄踞NGS市场的现状。尤其是HiSeq系列测序仪的问世，以通量高，产量大，生产规模著称，能够快速、经济的进行大规模平行测序，在大型全基因组测序，全转录组，全外显子组测序，靶向基因测序方面优势明显。
338 | 
339 | 下面是illumina测序仪产品发布的时间线：
340 | 
341 | 发布日期|测序仪型号
342 | ---|---
343 | 2010.01| HiSeq 2000
344 | 2011.02| MiSeq
345 | 2012.01| HiSeq 2500
346 | 2013.11| MiSeq Dx
347 | 2014.01| HiSeq X Ten，NextSeq 500
348 | 2015.01| HiSeq X Five，HiSeq 3000，HiSeq 4000，NextSeq 550，MiSeq FGx
349 | 2016.01| MiniSeq
350 | 2017.01| NovaSeqTM系列
351 | 
352 | 
353 | HiSeq 3000/4000系统则基于成熟的HiSeq 2500系统，采用创新的有序流动槽技术最大限度提高效率，3.5天内可完成12个基因组、100个转录组或180个外显子组测序。HiSeq 3000/HiSeq 4000测序系统为生产级测序能力设立了一个全新的标准。
354 | 
355 | HiSeq X Ten系统的问世完成了人类历史上一大里程碑事件——千元基因组时代的到来。HiSeq X Ten系统是由一套共10台超高通量的HiSeq X仪器组成，每年能带来超过18,000个人类基因组，而每个基因组的价格约为1000美元，让癌症和复杂疾病的研究达到新的水平。虽然目前GEO里面的数据HiSeq X Ten测序仪产出的数据并不是独占鳌头，但也只是时间问题。
356 | 
357 | NovaSeq系列测序仪问世，毫无疑问标志着测序新纪元的到来，旨在将基因组测序的价格进一步降至100美元。全新的NovaSeq系列测序系统，突破技术革新，具有可扩展的通量、灵活简便的配置和简化的操作流程，允许以更大的深度来发现罕见的遗传变异，为大规模发现复杂疾病变异打开了全新的市场。**NovaSeq 测序平台单次运行最多可检测48个人类基因组，产出 6Tb 的数据量，运行时间缩短至40个小时。**
358 | 
359 | 
360 | illumina技术核心在于桥式PCR和边合成边测序（SBS）。illumina测序系统的碱基读取也是基于化学发光法来的，给每一个碱基加入荧光基团，通过拍照捕捉发光的碱基，如此就得到了DNA的原始序列信息。
361 | 
362 | 也就是说，illumina原始读取的是图像数据文件，解析后才形成碱基序列文件。对应到序列文件，其测序源文件为BCL格式文件（per-cycle BCL basecall file），BCL是一种包含碱基信号和图块质量信息的二进制文件，在进入下游分析前，BCL文件会经由Casava碱基识别(Base Calling)转化为原始测序序列（Sequenced Reads），转化得到的序列我们称之为Raw Data或Raw Reads，格式为Fastq。
363 | 
364 | Fastq是一种文件文件，如果Fastq文件大小在M级，一般可以直接用文本编辑器（如Notepad++）打开。打开之后，就可以看到类似下面表格中第二列的内容，每四行记录一段序列，这个序列也是有名字的，叫reads。如果采用的是illumina MiSeq PE250，则第二行碱基和第四行碱基质量值均为250个，即reads长度为250 bp。
365 | 
366 | 
367 | |Illumina Seqence identifier|\@HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1|  
368 | |---------------------------|:------------------------------:| 
369 | |Read bases	|GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAG...|
370 | |+	|+|
371 | |Phred quality scores(ASCII)|	!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+。。。|
372 |  
373 | 首行*illumina sequence identifier**记录的信息比较复杂
374 | 
375 | illumina sequence identifier中包含了此次测序的信息，根据平台不同包含的信息有所区别，一般来说可能包含以下的部分元素：
376 | ```
377 | @<instrument>:<run number>:<flowcell ID>:<lane>:<tile>:<x-pos>:<y-pos>:<UMI> <read>:<is filtered>:<control number>:<index>
378 | ```
379 | 
380 | 我们再回头看上面的例子，就可以对应查看这条序列文件中的测序信息了： 
381 | 
382 | |标识符|解释|  
383 | |-----|:---:|
384 | |@|必须以\@开头|
385 | |HWUSI-EAS100R|	the unique instrument name|
386 | |6|flowcell lane|
387 | |73|tile number within the flowcell lane|
388 | |941|'x'-coordinate of the cluster within the tile|
389 | |1973|'y'-coordinate of the cluster within the tile|
390 | |#0|index number for a multiplexed sample (0 for no indexing)|
391 | |/1|the member of a pair, /1 or /2 (paired-end or mate-pair reads only)|
392 | 
393 | 注：Run、Flowcell、Lane和tile的详细辨析，我们在第2章节还会更详细的讲解fastq格式的数据。
394 | 
395 | 
396 | ## 2.5代测序
397 | 
398 | > Ion Torrent  测序仪是第一个不需要光学系统的商业测序仪，所采用的技术为半导体测序，通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号。是非常适合扩增子测序的革命性技术。它是一种经济、快速、简单、规模可扩展的测序技术。因为测序时间短，仪器设备便宜等特点而被各种研究所采用。
399 | 
400 | **一、前世今生**
401 | 
402 | Ion Torrent平台最初由Jonathan Rothberg于2007年开发，几经转手，2013年后归属Thermo Fisher，是他们家的掌中宝。目前有2010年发布的PGM，2012年发布Proton，2015年发布了Ion S5/XL。主要利用半导体芯片（无需荧光标记）技术，具有经济、快速、简单、规模可扩展的特点，适用于临床诊断和医学等使用场景，目前国内已有达安OEM版本DA8600。值得一提的是部分ion torrent测序仪受到了CFDA的认证。
403 | 
404 | **二、半导体测序原理** 
405 | 
406 | Ion Torrent的核心是半导体芯片测序技术，该技术采集的信号为pH值的变化，其他第二代测序技术主要是通过拍照采集荧光信号。该技术的主要优点是快速，主要缺点与Roche公司的454技术相同，在判读单碱基重复序列时存在困难。
407 | 
408 | 自然情况下，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个H+，导致局部可检验的PH值发生变化。如果发生结合，就会释放H+,相应的溶液PH值会发生改变，被离子传感器检测到，从而转换为数字信号。
409 | 
410 | 
411 | 如果检测DNA链上有两个相同的碱基，检测到的电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。
412 | 
413 | 如果模板到的下个核苷酸与微芯片流的核苷酸不匹配，则检测不到电压，也不会记录碱基。
414 | 
415 | 
416 | 
417 | **三、优缺点** 
418 | 
419 | torrent测序仪拥有图形化的用户界面，便捷的操作方式，商业化的试剂盒，这肯定是专门为医院的朋友们准备的，他们不需要具体的代码与分析原理，只需要按照protocol一步步照着做，点点按钮就能生成可用的临床报告了，应该说想法是好的，客户定位是准确的。但是我觉得NGS从实验到分析那么多步骤，如果不懂NGS分析原理与流程，对图形化的参数与文件不了解，很可能得不到理想的分析结果从而对torrent丧失信心。而torrent软件相对比较封闭，专业的数据分析人员不太好下手，所以普遍对torrent数据敬而远之。
420 | 
421 | 
422 | 
423 | ## 三代测序
424 | 
425 | 层出不穷的三代小鲜肉中，表现最为亮眼的莫过于2010年推出的PacBio RS系列和2012年推出的Nanopore MinION。2015年PacBio又推出了万众瞩目的Sequel。
426 | 能进入三代测序仪队列的还有Nanopore公司，也在2017年推出了GridION，为更方便、快捷、准确、经济的测序提供了无限可能。
427 | 
428 | ### 异军突起的pacbio
429 | 
430 | PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。测序时，不需要对目标DNA进行PCR扩增，而是直接在目标片段两端加上两个发卡结构的接头，形成一个连续的环状结构。也因此，PacBio系统在读长上显示了极大的优势。目前比较受市场热捧的三代测序是PacBio的RSⅡ和2015年推出的Sequel。
431 | 
432 | PacBio下机产生的序列文件以HDF5格式存储。可以采用h5dump命令来查看H5文件内容。
433 | 
434 | **1. 查看碱基序列：**
435 | 
436 | 用代码``h5dump –d /PulseData/BaseCalls/Basecall raw.h5 > Basecall.info`` ,文件内容如下：
437 | 
438 | ```
439 | DATA {(0): 67, 71,67, 67, 65, 71, 67, 71, 65, 65, 84, 71, 71, 67, 84, 71, 67, (17): 71, 71, 71,71, 65, 65, 71, 67, 65, 71, 65, 65, 65, 84, 84, 65, 84, (34): 67, 67, 71, 84,65, 65, 65, 67, 84, 71, 84, 84, 71, 67, 84, 71, 67,
440 | ```
441 | 
442 | 该文件采用的ASCII码的编码方式存储的碱基序列：A=> 65, C=>67, G=>71, T=>84。
443 | 
444 | **2. 查看碱基质量值：**
445 | 
446 | 用代码``h5dump -d /PulseData/BaseCalls/QualityValue raw.h5 > Basecall.quality``,文件内容如下,其碱基质量值采用与illumina技术一致：
447 | 
448 | ```
449 | DATA {(0): 51, 44,42, 44, 24, 24, 51, 51, 51, 51, 50, 20, 20, 20, 50, 51, 51, (17): 48, 48, 48,47, 9, 9, 9, 51, 51, 46, 31, 31, 31, 31, 44, 51, 51, 30, (35): 30, 51, 51, 7,7, 7, 7, 51, 51, 44, 44, 44, 51, 51, 50, 27, 27, 26,
450 | ```
451 | 
452 | 
453 | ### 长到天际的Nanopore 
454 | 
455 | 
456 | Oxford Nanopore 公司2005年在英国牛津成立，其运用的纳米孔测序技术使得DNA链在一个单通道中就能够被解码和识别，而不需要将长链打断成小短链。由于实现了DNA聚合酶内在自身的延续性和反应速度，Nanopore读长更长速度更快；同时由于能直接检测每个碱基的特征性电流，因而能对修饰碱基进行测序，对于表观遗传学研究具有极高的价值；因此，这款长到天际的测序仪，非常有潜力横扫当前测序格局。
457 | 
458 | 2014年春天推出U盘大小的便携式MinION测序仪，仪器售价仅需$1000，据官网报道最长Reads可长达960 Kb，2014年10月推出平板大小的台式测序仪PromethION，有48个flow cell，可以单独运行也可以并行，2017年推出桌面式GridION X5测序仪。
459 | 
460 | Nanopore目前还主要在测试和生产阶段，尚未大规模应用，其应用主要体现在微生物等小基因组生物上。推出至今，其最亮眼的表现莫过于2014年西非埃博拉病毒爆发，MinION以最快的速度破译病毒序列，名噪一时。随着独特的纳米孔技术的成熟和完善，未来在即时检测、太空应用、大众检测等方面会有很大的想象空间。
461 | 
462 | Nanopore测序得到的序列文件的格式基础也是[HDF5](https://support.hdfgroup.org/HDF5/)，下机产生后缀为Fast5的序列文档。Fast5文件可经由[Poretools软件](http://poretools.readthedocs.io/en/latest/)转换为Fastq文件或Fasta，然后进行后续数据分析。
463 | 
464 | -  ①  应用Poretools将fast5转换为fastq，示例见：
465 | http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fastq
466 | - ②  应用Poretools将fast5转换为fasta，示例见：
467 | http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fasta
468 | 
469 | 
470 | 在测序市场中，一代测序因其准确度高，仍作为突变检测、单菌鉴定等的金标准而存在。
471 | 以illumina HiSeq和MiSeq为代表的二代测序势头强劲，主打低成本和高通量，2017新机型NovaSeq更宣称已将测序成本降至百美金。
472 | 科研市场上三代测序最常见的莫过于PacBio，辅以冉冉上升的新星Nanopore等，主打长读长策略，直击二代测序碎片化序列的软肋，在基因组de novo上表现不俗，错误率较高，但可被矫正。
473 | 
474 | 
475 | 
476 | 


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/04-statistics.Rmd:
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  1 | # 统计及可视化 {#statistics}
  2 | 
  3 | 数据分析过程中，检查要用到各种各样的统计学原理。甚至某个原理本身单独都可以讲解一本书。
  4 | 
  5 | ## 基本统计概念
  6 | 
  7 | ## 写在前面
  8 | 
  9 | 了解生物信息，所有人都绕不开的一部分是统计基础知识和相关实现方式。在这一章中，我们将会简要介绍在实际处理生物数据问题过程中会常碰到统计学概念以及如何使用R语言进行计算和分析。
 10 | 
 11 | 
 12 | ## 第一节 描述性统计量
 13 | 
 14 | 什么是统计学问题呢？通常为了解决一类问题，我们会观察一组和该问题相关的样本，利用总体中的这部分样本来推断总体的情况进而得到结论。在通过样本推断总体之前，我们首先需用对已有样本数据进行简单的评估和描述，针对这一需求也就引出了**描述统计量**这一概念。进行描述性统计时，我们最关注的数据两个层面的问题，分别是数据的集中趋势和变异分散性。
 15 | 
 16 | ### 数据的集中趋势 {-}
 17 | 
 18 | 面对少则几十个多则上千个数字，第一步通常是观察平均水平。这里介绍三个计算数据平均水平的概念。分别是均值(mean)、中位数(median)和众数(mode)。
 19 | 
 20 | **均值**：所有观察值的和除以观察的个数。通常，算数平均是最自然和常用的测度，其问题在于对异常值(outliers)非常敏感。有极端值存在时，均值不能代表样本的绝大多数情况。
 21 | 
 22 | **中位数**：所谓中位数，是指所有样本观测值由小到大排序，位于中间的一个（样本数为奇数）或者两个数据的平均值（样本数为偶数）。
 23 | 
 24 | 通常，当数据分布对称时，中位数近似等于算数平均数；当数据正倾斜时（画出的图像向右边倾斜），中位数小于算数平均数；当数据负倾斜时（画出的图像向左倾斜），中位数大于算数平均数。因此在很多情况下，我们可以通过比较样本的均值和中位数对数据的分布对称性进行一个初判断。
 25 | 
 26 | **众数**：在样本的所有观测值中，出现频率最大（出现次数最多）的数值称为众数。这里需要说明的是，当数据量很大而且数值不会多次重复出现时众数并不能给我带来太多的信息。比如当你计算上万个基因的表达量后，得到众数最可能的是0，因为每个基因的表达值或多或少都有一些不同，这时候出现最多的就是那些没有检测的表达基因的0了。
 27 | 
 28 | 但是在遇到类别数据而非数值型数据时，众数有很大用处，或者说众数是唯一可以用于类别数据的平均数。
 29 | 
 30 | 在R中，上述提到的均值和中位数可以通过`mean(data)`和`median(data)`函数进行计算,而中位数可以通过`modeest`包的`mfv(data)`函数得到。
 31 | 
 32 | 
 33 | ### 数据的变异性（离散性）  {-}
 34 | 
 35 | 平均数显然不能说明一切问题，因为在说明样本数据时我们还必须考虑数据是不是过于分散。例如在篮球队员的投篮平均得分相同的情况下，更重要的时知道他们哪些人发挥得更加稳定。
 36 | 
 37 | **极差(range)**指的是一个样本中最大值和最小值之间的差值。在统计学中也称为全距，它能够指出数据的“宽度”（范围）。但是，它和均值一样非常容易受到极端值得影响，而且会受到样本量的明显影响。
 38 | 
 39 | 针对极差的缺点，统计学中又引入了**分位数(quantiles)**的概念，通俗讲就是把数据的“宽度”细分后再去进行比较从而更好地描述数据的分布形态。分位数用三个点将从小到大排列好的数据分为四个相等部分，而这三个点也就是我们常说的四分位数，分别叫做下四分位数，中位数和上四分位数。当然，除了四分位你也可以计算十分位或者百分位。
 40 | 
 41 | 分位数的引进能够说明数值的位置，但是无法说明某个数值在该位置出现的概率。为了说明数据的稳定程度，我们可以考虑计算每个数据值到平均数的距离（此处，你可以脑补一个高瘦形的数据曲线和矮胖形的数据曲线），但是样本中所有观测值和均值的偏差和永远是0。为了解决这种正负距离相互抵消的问题，统计学中又引入了**方差(variance)**和**标准差(standard deviation)**的概念。
 42 | 
 43 | 所谓**方差**是指数值与均值距离平方数的平均数，而**标准差**则是方差的平方根。标准差体现了数据的变异度，标准差越小，数值和均值越近。通常，均值用μ表示，而标准差用σ表示。
 44 | 
 45 | 在R中，可以通过`quantile()`计算分位数，通过`var()`来计算方差，通过`sd()`来计算标准差。
 46 | 
 47 | 有个**标准差**的概念，随之而来的问题是当两个样本标准差相同但是均值相差很大时该如何做出区分。统计学中随之引入了**变异系数(coefficient of variation, CV)**的概念，变异系数是指样本标准差除以均值再乘100%。变异系数不会受数据尺度的影响，因此常用来进行不同样本之间变异性的比较。
 48 | 
 49 | 在实际的数据分析中，如果要比较不同数据集(均值和标准差都不同)之间的数值，通常会引入**z score**的概念，z score 的计算方法是用某一数值减去均值在除以标准差。通过对原始数据进行z变换，我们将不同数据集转化为一个新的均值为0，标准差为1的分布。
 50 | 
 51 | ### 计算描述性统计量 {-}
 52 | 
 53 | 在R中，使用`summary()`函数方便的得到一个data frame 的各种描述性统计量。当某一列是数值型变量时，你可以得到该列数据的均值、极值、方差和分位数。
 54 | 
 55 | 下面我们使用R中内置的数据**Edgar Anderson's Iris Data**进行一些简单展示。
 56 | 
 57 | ```{r iris}
 58 | summary(iris) 
 59 | 
 60 | #查看常用的描述统计量
 61 | ```
 62 | 
 63 | ### 形象化展示 {-}
 64 | 
 65 | 所谓形象化展示就是用图示的方法来展示数据结果，比较常见的方法有条形图，箱线图，直方图等。
 66 | 
 67 | 
 68 | ```{r}
 69 | boxplot(iris$Sepal.Length)
 70 | 
 71 | # 使用箱线图展示某一列数据的分布情况
 72 | 
 73 | ```
 74 | 
 75 | ```{r}
 76 | hist(iris$Sepal.Length)
 77 | 
 78 | # 使用直方图展示某一列数据的分布情况
 79 | 
 80 | ```
 81 | 
 82 | 
 83 | ```{r}
 84 | plot(ecdf(iris$Sepal.Length))
 85 | 
 86 | # 绘制简单的累积分布函数图展示某一列数据分布情况
 87 | 
 88 | ```
 89 | 
 90 | ## 第二节 概率相关
 91 | 
 92 | 统计学中的大量内容源于概率，学习统计学也就必须要了解一些概率中的基本概念，其中尤为重要的是条件概率，以及延伸出的贝叶斯定理（概率论中最牛也是最难掌握的内容之一）。
 93 | 
 94 | ### 几个需要理解的概念 {-}
 95 | 
 96 | **样本空间(sample space)**是所有可能结果的一个集合，**事件(event)**则是样本空间中所有感兴趣结果的一个子集。某事件的**概率(probability)**是该事件在无限次试验次数中的相对频率。
 97 | 
 98 | 事件的交集并集和补集，概率的加法法则乘法法则在这里不做更加详细的介绍。
 99 | 
100 | **条件概率(Conditional Probability)**用来描述与其他事件的发生相关的某个事件的概率，通常被描述成在A事件下发生事件B的概率。在书写过程中用“|”表示，例如P(A|B)就是在B发生的情况下A发生的概率。计算方式为AB同时发生的次数除以所有B发生的次数。
101 | 
102 | 条件概率计算方法：$P(A|B)=P(A\cap B)/P(B)$
103 | 
104 | 也可推出 $P(B|A)=P(A\cap B)/P(A)$ => $P(A\cap B)=P(A)\times P(B|A)$
105 | 
106 | 全概率公式：$P(B)=P(A)\times P(B|A)+P(A')\times P(B|A')$ （贝叶斯定理的分母部分）
107 | 
108 | 贝叶斯定理：$P(A|B)=\frac{P(A)\times P(B/A)}{P(A)\times P(B|A)+P(A')\times P(B|A')}$
109 | 
110 | 得到的贝叶斯定理可以帮助我们计算逆条件概率。
111 | 
112 | 在实际的生物学数据处理的过程中，我们还会接触到**灵敏度(sensitivity)**、**特异度(specificity)**、**假阳性(false negative)**和**假阴性(false  positive)** 这几个概念。在疾病方面，对于某一个症状，通俗地说灵敏度指发病后出现症状的概率，特异度不发病时不出现症状的概率。假阳性是指实验结果阳性但是实际为阴性，假阴性是指实验结果为阴性但是实际为阳性。基于灵敏度和特异度，我们经常会看到ROC曲线，通常来说在两个检验中，曲线下面积大的较好。
113 | 
114 | 概率能够告诉我们事件发生的可能性，但如果想要利用概率预测未来的结果并且评估预测的确定性就需要引入概率分布的概念。
115 | 
116 | ### 离散概率分布 {-}
117 | 
118 | **随机变量**： 样本空间中，对不同事件指定有相应概率的数值函数。
119 | 
120 | 随机变量是可以等于一系列数值的变量，这些值又都和一个特定的概率关联。它的写法是P(X=x)，表示随机变量X取特定值为x时的概率。随机变量包括离散和连续两种形式，所谓离散指变量只能取一些确定值。连续指的是有无限多种可能取值。
121 | 
122 | **概率分布**也叫概率质量分布，$P(X=x)$。在描述统计量中，样本的频数分布描述每个取值以及对应发生次数，如果样本总数除以对应发生次数，得到的频率分布就类似于这里的概率分布。而所谓的“拟合优度检验”就是比较有限样本频率分布和概率分布的差异。
123 | 
124 | 如果将随机变量和样本对应起来，那么样本中均值的概念在总体（随机变量）中称为**期望**，也叫作**总体均值**，表示为$\mu$（和均值一致）或者$E(X)$。计算方式是将每个可能值和概率相乘再把所有乘机相加。和均值类似，这里的期望无法描述相关数值的分散程度。
125 | 
126 | 同样的，在随机变量中也有类似于样本方差的概念，称为**总体方差**（随机变量方差），用来表示分散程度。其计算公式为 $Var(X) = E(X-\mu)^{2}$。而概率分布的标准差σ同样是方差的平方根。
127 | 
128 | 计算$E(X-\mu)^{2}$时，首先计算每个数值x的$(x-\mu)^{2}$,然后再将结果乘以概率，最后把所有结果相加。
129 | 
130 | 在数据集中，方差和标准差表示的是数据和均值的距离，在概率分布中特定数值概率的分散情况。方差越小，结果越接近期望。
131 | 
132 | **累加分布函数(cumulative-distribution function, cdf)**:随机变量X，对于X的任一指定值x，概率值$P(X\leq x)$。即随机变量取值不大于指定值的概率。记作$F(x)$
133 | 
134 | ### 常见的离散概率分布 {-}
135 | 
136 | **几何分布**：进行一组相互独立实验，每次实验有成功失败两种可能且每次试验概率相等，想知道第一次成功需要进行的试验次数。
137 | $$P(X=r)=pq^{r-1}$$
138 | $$P(X>r)=q^{r}$$
139 | $$P(X \leq r)=1-q^{r}$$
140 | 
141 | 期望$E(X)=\frac{1}{x}$;方差 $Var(X)=\frac{q}{p^{2}}$
142 | 
143 | 
144 | **二项分布**：进行一组相互独立试验，每次实验有成功失败两种可能且每次试验概率相等且*试验次数有限*，想知道在有限次试验中成功的次数。
145 | $$P(X=r)=C^{r}_{n}p^{r}q^{n-r}$$
146 | 期望$E(X)=np$;方差$Var(X)=npq$
147 | 
148 | 二项分布和几何分布差别在于，试验次数固定求成功概率用二项分布，求第一次成功前试验次数用几何分布。
149 | 
150 | **泊松分布**：常与稀有事件相关，单独事件在给定区间（区间可以是时间或者空间）内随机独立发生，该区间内的事件平均发生次数已知且为有限值。这个值用$\lambda$表示。给定区间内发生r次事件个概率计算公式：$$P(X=r)=\frac{e^{-\lambda}\lambda^{r}}{r!}$$
151 | 期望是给定区间内能够期望的事件发生次数λ，方差也是λ。如果一个离散随机变量的一批数据计算后方差和均值近似相等，则可以推测样本符合泊松分布。
152 | 
153 | 当二项分布的p很小且n非常大时，$npq\approx np$,方差和期望近似相等，可以用泊松分布来近似二项分布，从而使计算简化。通常，n大于50且p<0.1时为典型的近似情况。
154 | 
155 | ### 连续概率分布 {-}
156 | 
157 | 当数据是连续分布时，人们关心的是取得某一个特定范围的概率。
158 | 
159 | **概率密度函数(probability density function, pdf)**:本质是一个函数，用这个函数可以求出在一个范围内的某连续变量的概率，同时该函数可以指出该概率分布的形状。换句话讲，任意a,b两点之间及函数对应曲线下组成的面积等于随机变量X落在ab间的概率。曲线下面积总和是1。
160 | 
161 | 所谓概率密度可以指出各种范围内的概率大小，用面积来表示。只是表示概率的一种方法而非概率本身。
162 | 
163 | **累加分布函数**a点上的值等于随机变量X取值$\leq a$的概率，也是概率密度函数a左边曲线下的面积。
164 | 
165 | **正态分布**是连续数据的一种理想状态。正态分布的概率密度函数是一条对称的钟形曲线，均值具有最大的概率密度，偏离均值概率密度越小。参数μ是均值，也是曲线的中央位置，$\sigma$表述曲线的胖瘦。
166 | 
167 | 连续随机变量X符合均值为μ，标准差为$\sigma$的正态分布时写作$X\sim N(\mu,\sigma^{2})$.
168 | 
169 | 线性变换$$aX+b \sim N(a\mu +b,a^{2}\sigma^{2})$$
170 | 当X和Y**相互独立**（彼此之间没有影响）时：
171 | $$X+Y \sim N(\mu_{x}+\mu_{y},\sigma_{x}^{2}+\sigma_{y}^{2})$$
172 | $$X-Y \sim N(\mu_{x}-\mu_{y},\sigma_{x}^{2}+\sigma_{y}^{2})$$
173 | 期望$E(X_{1}+X_{2}+...+X_{n})=nE(X)$;方差$Var(X_{1}+X_{2}+...+X_{n})=nVar(X)$
174 | 
175 | 当X和Y并不彼此独立时，使用**协方差(Covariance)**来描述两个随机变量间的关系，记做Cov(X,Y)
176 | $$Cov(X,Y)=E[(X-\mu_{x})(Y-\mu_{y})]$$
177 | 
178 | 
179 | **二项分布正态近似**：通常情况，当二项分布满足$np\geq 5$ (也有建议$npq\geq 5$)时，可以用正态分布代替二项分布。其中$\mu = np$,$\sigma^{2}=npq$。另外，当泊松分布的λ>15时，也可以用正态分布进行近似。
180 | 
181 | 
182 | ## 第三节 估计
183 | 
184 | 在通常的试验中，我们获得的信息同时从样本中获得的。想要知道总体参数，只能通过以后样本的参数进行估计。
185 | 
186 | 样本均值是总体均值的点估计。通常，样本均值是用$\overline x$表示，总体均值用$\mu$表示。
187 | 
188 | 在估计总体方差$\sigma^2$时，计算公式为:$$\sigma^2=\frac{\Sigma(x-\overline x)^2}{n-1}$$
189 | 
190 | 用样本方差估计总体方差会使得估计结果偏低，样本越小，两个方差的差别可能就越大。在这里，估计总体方差的公式除以$n-1$，更接近总体方差。另外，总体方差点估计公式通常记做$s^2$,写作：$$s^2=\frac{\Sigma(x-\overline x)^2}{n-1}$$
191 | 
192 | 用样本均值估计总体均值时会产生误差，均值的标准误差是$\sigma/\sqrt{n}$，估计量是$s/\sqrt{n}$。标准误差表示样本均值的分散情况，从公式中我们可以看出，n越大，用样本均值估计总体均值越准去。当样本足够大（大于30）时，即便总体不符合正态分布，但从中取出的样本均值分布仍然近似于正态分布（中心极限定理）。$\overline X$~$N(\mu, \sigma^2/n)$
193 | 
194 | 除了对总体进行点估计以外，我们往往还会对总体进行区间估计，即对通过点估计得到的结果加减一定范围的误差。
195 | 
196 | ## 第四节 相关性分析
197 | 
198 | 本节提到的相关性分析以及后面会提到的t-test, ANOVA 以及回归分析被称为参数检验，这些检验在进行时我们都默认数据符合某种分布，我们的数据符合一定前提条件，通常包括数据符合正态分布和方差相等。当样本数量大于30的时候，根据中心极限定理，我们通常认为数据符合正态分布。在进行t-test和ANOVA分析时，还需要满足样本方差相等条件。
199 | 
200 | 在进行各种检验之前往往需要初步检验一下数据是否符合某种检验的前提条件，如果不符合则应该考虑使用非参数检验等其他方法。
201 | 
202 | ### 正态分布评估 {-}
203 | 
204 | 在评估数据集是否符合正态分布时通常会采用** Shapiro-Wilk’s test**和图示（Q-Q plot）结合的方法。使用Q-Q plot(quantile-quantile plot)的结果比较直观，使用Shapiro-Wilk’s test显著性检验的方法更加准确（相对而言）。
205 | 
206 | Shapiro-Wilk’s test 结果受样本量的影响非常大，当样本量很大时，即便数据符合正态分布也容易出现p值很小进而拒绝原假设的情况（该检验原假设是样本来自于正态分布）。样本量很小时，即便真实数据不符合正态分布，也可能接受原假设。
207 | 
208 | 这里试举一例
209 | 
210 | ```{r}
211 | # 分别随机生成两组二项分布和指数分布随机数
212 | set.seed(90)
213 | x <- rbinom(15,8,0.7)
214 | y <- rexp(15,0.5)
215 | shapiro.test(x)
216 | shapiro.test(y)
217 | 
218 | 
219 | ```
220 | 
221 | 可以发现即便我们生成的两个样本都不是正态分布，但是检验的结果仍然没有拒绝原假设（没有拒绝不等于接受原假设）。
222 | 
223 | 好在R中这个函数限制了检测的样本个数，3到5000。因此，同时结合图像来看还是很必要的。
224 | 
225 | 一般使用qqplot来检验是否符合正态分布，R中默认的函数是`qqnorm()`，ggplot2中可以使用函数`qplot()`，qqpubr包是基于ggplot2的简易升级版，操作更加友好，可以使用函数`ggqqplot()`。
226 | 
227 | 下面利用生成的数据绘图。
228 | 
229 | ```{r}
230 | # 生成符合正态分布的一组数据并绘图
231 | z <- rnorm(50)
232 | qqnorm(z)
233 | 
234 | library(ggplot2)
235 | qplot(sample=z)
236 | 
237 | library(ggpubr)
238 | ggqqplot(z)
239 | 
240 | ```
241 | 
242 | ### 相关性分析 {-}
243 | 
244 | Pearson相关系数、Spearman相关系数、Kendall相关系数都可以用来表示变量之间的相关性，一般情况下，使用pearson相关系数更多，如果比较明确样本不符合正态分布的时候可以使用kendall或者spearman相关系数。这三种相关系数都可以通过`cor()`函数来进行计算。下面通过R已有数据集cars，查看汽车车速和刹车距离之间的相关性。
245 | 
246 | pearson相关系数计算公式
247 | $$r = \frac{\sum{(x-m_x)(y-m_y)}}{\sqrt{\sum{(x-m_x)^2}\sum{(y-m_y)^2}}}$$
248 | 其中m表示均值。
249 | 
250 | ```{r}
251 | cor(cars, method = "pearson")
252 | 
253 | ```
254 | 
255 | ### 相关性可视化展示 {-}
256 | 
257 | 可以使用散点图进行两个变量之间的相关性展示。
258 | 
259 | ```{r}
260 | plot(cars)
261 | 
262 | ggplot(cars, aes(x=speed, y=dist))+ geom_point()
263 | 
264 | ggscatter(cars,x="speed", y="dist",add = "reg.line", conf.int = T,cor.coef = T)
265 | 
266 | ```
267 | 
268 | ### Pearson 相关性检验 {-}
269 | 
270 | 前面我们只是计算了两个变量之间的相关性，还应该对相关进行显著性检验。原假设为变量之间没有相关性，使用函数为`cor.test()`
271 | 
272 | ```{r}
273 | cor.test(cars$speed,cars$dist,alternative = "two.side", method = "pearson")
274 | 
275 | ```
276 | 
277 | 统计结果中，t表示t检验值，df表示自由度，pvalue是t检验的显著性水平，conf.int表示95%的置信区间，sample estimates 是相关系数。相关系数越接近-1表示负相关，接近1表示正相关。
278 | 
279 | 
280 | ## 常用统计方法
281 | 
282 | ### 差异分析
283 | 差异分析一般指的是寻找
284 | 
285 | ### 生存分析
286 | 
287 | ### 主成分分析
288 | 
289 | ### 进化树
290 | 
291 | ## 常用可视化工具
292 | 
293 | ### 网页工具
294 | 
295 | ### 本地软件
296 | 
297 | > IGV等
298 | 
299 | ### R绘图系统
300 | 
301 | 这部分内容主要从总体上介绍R的两大作图系统：传统绘图系统和grid绘图系统。尽管这部分不会详细介绍如何去绘制某一种具体的图形，但是了解这部分知识却能帮助你在日后作图时根据需求修改已有的绘图工具。
302 | 
303 | 无论是传统绘图系统还是grid绘图系统，它们都是建立在`grDevices`包的基础上。`grDevices`被称之为绘图引擎，提供了一系列R中的基本绘图函数，负责绘图参数和图片输出，并且几乎所有的高级的绘图函数都是建立在它的基础上。虽然它如此重要，功能十分强大，但由于太过底层，一般只有R包开发者才会深入研究。建立在绘图引擎之上，有两套互不相容的绘图包：`graphics` 包和 `grid` 包，将R的绘图功能从主体上一分为二。
304 | 
305 | **传统绘图系统**：graphics包之所以称其为传统绘图系统，是因为它实现了很多S语言（S语言由贝尔实验室开发并投入商用）所使用的绘图工具，比如说能用于绘制散点图和条形图的`plot()`，能用于绘制饼图的`pie()`，能用于绘制条形图的`barplot()`，而且每一个作图函数都提供了大量的图形参数用于修改图形。我们可以通过`library(help="graphics")`查看有哪些绘图函数，使用`demo("graphics")`了解传统绘图系统能绘制哪些图形。
306 | 
307 | 
308 | **GRID绘图系统**: grid包与传统绘图系统不同，它不负责提供完整的图形函数。它的强大之处在于提供了基于**视图概念**定位区域的强大能力，相当于将R变成了Photoshop，也就是意味着你可以将图形视为不同区域元素的叠加，也意味着你可以做出非常复杂的图形，比如说下图
309 | ```{r circle}
310 | library(grid)
311 | grid.newpage()
312 | grid.circle(x=seq(0.1,0.9,length=100),
313 |             y=0.5 + 0.4*sin(seq(0,2*pi,length=100)),
314 |             r=abs(0.1*cos(seq(0, 2 *pi, length=100))))
315 | # 图形来自于R会图形系统（第二版）
316 | ```
317 | 
318 | 不过人们基本上不会直接使用grid绘制统计图形，一般是采用基于**画笔系统**的`lattice`包或基于**图形语法**的`ggplot2`。 你或许会问，“知道`lattice`和`ggplot2`是基于`grid`对今后作图由什么帮助吗？”。这里就谈及一点，你可以使用`grid`定制`ggplot2`输出，也就是将多幅图形集中在一起.
319 | ```{r multi-plot}
320 | library(ggplot2)
321 | grid.newpage()
322 | pushViewport(viewport(x=0, width=1/3, just="left"))
323 | print(ggplot(mtcars, aes(x=vs)) + 
324 |         geom_bar(),
325 |       newpage=FALSE)
326 | popViewport()
327 | pushViewport(viewport(x=1/3,width=2/3, just="left"))
328 | print(ggplot(mtcars, aes(x=disp, y=mpg)) +
329 |   geom_point(aes(color=drat)),
330 |   newpage=FALSE)
331 |   
332 | ```
333 | 
334 | 以上仅仅R语言图形系统的简单介绍，如果你只是想要绘制简单的图形，你只要继续看[如何通过Google来使用ggplot2可视化](http://mp.weixin.qq.com/s/WN4TSMNjH4b6vZgYVjaRvQ) 这一篇就够用了。但是如果你希望用R，而不是PS和AI，去随心所欲绘制出任何图形，那么你需要至少看完如下3本书：
335 | 
336 | - [ggplot2：数据分析与图形艺术](https://book.douban.com/subject/24527091/)
337 | - [R数据可视化手册](https://book.douban.com/subject/25873705/)
338 | - [R绘图系统](https://book.douban.com/subject/26792674/)
339 | 
340 | ## 可视化举例
341 | 
342 | ### 表达矩阵可视化大全
343 | 
344 | 无论是芯片数据，还是高通量测序，结果总能得到每个样本的基因表达量数据。而将这些数据导入到R语言，就能得到一组表达量矩阵。对于这组数据，至少可以绘制如下图形
345 | 
346 | - 箱形图(boxplot)
347 | - 小提琴图(vioplot)
348 | - 柱状图(histogram)
349 | - 密度图(density)
350 | - 配对图(gpairs)
351 | - 聚类图(cluster)
352 | - 主成分分析(PCA)
353 | - 热图(heatmap)
354 | - 火山图(volcano plot)
355 | 
356 | 在绘制这些图形之前，首先需要先安装加载一系列包
357 | ```{r ,message=FALSE, warning=FALSE}
358 | if (! require('corrplot')) {install.packages("corrplot"); require('corrplot') }
359 | if (! require('gpairs')) {install.packages("gpairs"); require('gpairs') }
360 | if (! require('vioplot')) {install.packages("vioplot"); require('vioplot') }
361 | if (! require('tidyverse')) {install.packages("tidyverse"); require('tidyverse') }
362 | if (! require('RColorBrewer')) {install.packages("RColorBrewer"); require('RColorBrewer') }
363 | source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
364 | if (! require('CLL')) {biocLite("CLL"); require('CLL') }
365 | if (! require('pheatmap')) {biocLite("pheatmap"); require('pheatmap') }
366 | if (! require('limma')) {biocLite("limma"); require('limma') }
367 | ```
368 | 
369 | 随后是加载绘图所需的表达矩阵数据。分析所用的表达矩阵数据对象(ExpressionSet obejct)由[Affymetrix](#Affymetrix)的 AffyBatch 对象经 gcrma 处理后获得。
370 | 
371 | 原数据为22组样本的12,625个基因表达状况，根据疾病状态分为两组：stable 或 progressive，此处仅选取前8个样本用作演示。
372 | 
373 | **注**: gcrma是Bioconductor中一个与芯片数据处理相关的包,主要功能是利用序列信息调整背景.
374 | ```{r, message=FALSE, warning=FALSE}
375 | data("sCLLex")
376 | sCLLex <- sCLLex[,1:8] # 样本数过多，仅选取前8个
377 | group_List <- sCLLex$Disease # 获取分组信息
378 | exprSet <- exprs(sCLLex) # 获取表达矩阵
379 | head(exprSet, n=3)
380 | ```
381 | 
382 | 之后，还要利用`tidyr::gather`将原本的**宽数据**重塑成**长数据**。这一步被称之为数据规整化，是数据分析流程中至关重要的一步，详见Hadley所写的[Tidy data](http://r4ds.had.co.nz/tidy-data.html) 一章。当前数据存在问题是：列名(CLLxx.cCEL)应该是变量名，而这里却是变量的值。
383 | ```{r tidy-it}
384 | exprSet <- as.data.frame(exprSet)
385 | exprSet$probe <- row.names(exprSet)
386 | exprSet_L <- tidyr::gather(exprSet, key='sample',value='value',CLL11.CEL:CLL18.CEL)
387 | exprSet_L$group <- rep(group_List, each=nrow(exprSet))
388 | rbind(head(exprSet_L,2), tail(exprSet_L,2))
389 | ```
390 | 
391 | 经过这基本处理，便能得到以探针，样本，处理结果和组别信息为列名的数据框。
392 | 
393 | 完成了上述准备工作后，先用箱形图，小提琴图，柱状图，密度图了解各个样本表达数据的分布情况。
394 | ```{r distribution}
395 | library(ggplot2)
396 | library(grid)
397 | grid.newpage()
398 | pushViewport(viewport(x=0, width=1/2, just="left"))
399 | p1 <- ggplot(exprSet_L,aes(x=sample,y=value,fill=group)) + geom_boxplot() +
400 |   theme(axis.text.x = element_text(angle=90, hjust=1, vjust=.5))
401 | print(p1, newpage=FALSE)
402 | popViewport()
403 | pushViewport(viewport(x=1/2, width=1/2, just="left"))
404 | p2 <- ggplot(exprSet_L,aes(x=sample,y=value,fill=group)) + geom_violin() + 
405 |   theme(axis.text.x = element_text(angle=90, hjust=1, vjust=.5))
406 | print(p2, newpage=FALSE)
407 | ```
408 | 
409 | 其中小提琴图可以认为是箱形图与核密度图的结合体。
410 | 
411 | ```{r density-plot}
412 | library(ggplot2)
413 | # 条形图
414 | p3 <- ggplot(exprSet_L,aes(value,fill=group)) + geom_histogram(bins = 200)+facet_wrap(~sample, nrow = 4)
415 | print(p3)
416 | # 密度图
417 | p4 <- ggplot(exprSet_L,aes(value,col=group)) + geom_density()+facet_wrap(~sample, nrow = 4)
418 | print(p4)
419 | ```
420 | 这里使用了ggplot2的分面特性，`fact_wrao()`为每一个变量都绘制相应的图。如果不使用分面，还可以观察不同分组数据在同一幅图中的分布情况。
421 | ```{r}
422 | p5 <- ggplot(exprSet_L,aes(value,col=group)) + geom_density() 
423 | print(p5)
424 | ```
425 | 
426 | 上面提及的四类图形描述的都是每一组样本各自的情况，而下面谈到的`gpairs`和`cluster`则是探索不同变量之间的关系。
427 | 
428 | **配对关系图**：`gpairs`能够产生分组变量两两之间的关系。要求的输入数据为**宽数据**，即每列代表不同的细胞，每行表示不同的基因。
429 | ```{r gpairs, warning=FALSE}
430 | library(gpairs)
431 | gpairs(exprSet[,1:8]
432 |        #,upper.pars = list(scatter = 'stats') 
433 |        #,lower.pars = list(scatter = 'corrgram')
434 |       )
435 | ```
436 | 
437 | **聚类图**： 通过计算基因表达量之间的欧几里得距离，从而对不同样本进行分类。
438 | ```{r cluster}
439 | out.dist=dist(t(exprSet[1:8]),method='euclidean')
440 | out.hclust=hclust(out.dist,method='complete')
441 | plot(out.hclust)
442 | ```
443 | 
444 | **热图(heatmap)**： 本质上类似于散点图，只不过它利用颜色深浅表征数据的大小，以矩阵替代点。如果颜色表示为两个样本之间的距离，可以结合上面的聚类图，用来探索不同处理样本之间的差异。
445 | ```{r heatmap1}
446 | sampleDistMatrix <- as.matrix( out.dist )
447 | rownames(sampleDistMatrix) <- paste(colnames(exprSet[1:8]), group_List,sep="-")
448 | colnames(sampleDistMatrix) <- NULL
449 | colors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, "Blues")) )(255)
450 | pheatmap(sampleDistMatrix,
451 |          clustering_distance_rows = out.dist,
452 |          clustering_distance_cols = out.dist,
453 |          col = colors)
454 | ```
455 | 
456 | 当然，也能用热图揭示不同样本间基因表达模式的差异，这里颜色就用来表征基因表达量。
457 | ```{r heatmap-2}
458 | # 选择表达量较高的基因
459 | choose_gene <- names(sort(apply(exprSet[1:8], 1, mad),decreasing = T)[1:50])
460 | choose_matrix <- exprSet[choose_gene, ][1:8]
461 | choose_matrix <- scale(choose_matrix)
462 | 
463 | # 使用pheatmap绘图
464 | rownames(choose_matrix) <- rownames(choose_matrix)
465 | colnames(choose_matrix) <- group_List
466 | colors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, "Blues")) )(255)
467 | pheatmap(choose_matrix,
468 |          col = colors,
469 |          fontsize_row = 5)
470 | ```
471 | 除了`pheatmap`，`gplots`包的`heatmap.2()`和自带的`heatmap`也能绘制热图。热图是否美观主要取决于整体配色。下图直观的表达了一个观点，合理的配色是可视化效果的加分项。
472 | ```{r heatmap-3}
473 | heatmap(choose_matrix)
474 | ```
475 | 
476 | **PCA**: PCA本质是散点图，X和Y轴表示不同主成分，不同点之间的距离表示样本之间在两个主成分下的差异。
477 | ```{r}
478 | pc <- prcomp(t(exprSet[1:8]),scale=TRUE)
479 | pcx <- data.frame(pc$x)
480 | pcr <- cbind(samples = rownames(pcx),group_List, pcx) 
481 | p <- ggplot(pcr, aes(PC1, PC2)) + geom_point(size = 5, aes(color = group_List)) +
482 |   geom_text(aes(label = samples),hjust = -0.1, vjust = -0.3)
483 | print(p)
484 | ```
485 | 
486 | **火山图**：火山图主要用在差异表达分析之后，用于直观地进行样本间差异基因筛选。本质上依旧是散点图，X轴表示取对数后的倍数变化(log2 Fold Change), Y轴则表示取对数后的显著性水平
487 | ```{r}
488 | design <- model.matrix(~factor(group_List))
489 | fit <- lmFit(exprSet[1:8],design)
490 | fit <- eBayes(fit)
491 | DEG <- topTable(fit,coef=2,n=Inf)
492 | with(DEG, plot(logFC, -log10(P.Value), pch=20, main="Volcano plot"))   
493 | ```
494 | 
495 | 火山图既然本质上是散点图，那么只要以log2FC和-log10 pvalue 构建数据框，就可以使用 ggplot2 进行绘图，对目标区域进行高亮显示。
496 | ```{r}
497 | logFC_cutoff <- with(DEG,mean(abs( logFC)) + 2*sd(abs( logFC)) )
498 | DEG$change <-  as.factor(ifelse(DEG$P.Value < 0.05 & abs(DEG$logFC) > logFC_cutoff,
499 |                               ifelse(DEG$logFC > logFC_cutoff ,'UP','DOWN'),'NOT')
500 |                        )
501 | this_tile <- paste0('Cutoff for logFC is ',round(logFC_cutoff,3),
502 |                     '\nThe number of up gene is ',nrow(DEG[DEG$change =='UP',]) ,
503 |                     '\nThe number of down gene is ',nrow(DEG[DEG$change =='DOWN',])
504 | )
505 | 
506 | g <-  ggplot(data=DEG, aes(x=logFC, y=-log10(P.Value), color=change)) +
507 |   geom_point(alpha=0.4, size=1.75) +
508 |   theme_set(theme_set(theme_bw(base_size=20)))+
509 |   xlab("log2 fold change") + ylab("-log10 p-value") +
510 |   ggtitle( this_tile  ) + theme(plot.title = element_text(size=15,hjust = 0.5))+
511 |   scale_colour_manual(values = c('blue','black','red'))  ## corresponding to the levels(res$change)
512 | print(g)
513 | ```
514 | 
515 | ### 染色体结构图
516 | 
517 | ### 转录本结构图
518 | 
519 | RNA转录翻译时存在可变剪切，因此同一个基因在不同时间和空间下会产生不同的转录本。[GTF和GFF](#GTF和GFF) 在数据存放类型一章介绍过，用于注释基因组上的基因。
520 | 
521 | 对转录本结构进行可视化的本质在于理解，Y轴用于区分不同的基因，X轴则表示染色体距离，以矩阵长度表示基因元件的起始和结束。因此，可以使用ggplot2[根据GTF画基因的多个转录本结构](https://mp.weixin.qq.com/s/UySUZRIpfX0VhNqveTPHwQ)
522 | 
523 | ```{r }
524 | gtf <- read.table("data/ANXA1.gencode.v7.gtf",stringsAsFactors = F,header = F,comment.char = "#",sep = '\t')
525 | gtf <- gtf[gtf[,2] =='HAVANA',]
526 | gtf <- gtf[grepl('protein_coding',gtf[,9]),]               
527 | gtf$gene <- sapply(as.character(gtf[,9]), function(x) sub(".*gene_name\\s([^;]+);.*", "\\1", x))
528 | draw_gene <- 'ANXA1'
529 | structure <- gtf[gtf$gene==draw_gene,c(1,3:5)]
530 | names(structure) <- c("chr", "record", "start", "end")
531 | idx <- which(structure$record == "transcript")
532 | s <- idx+1
533 | e <- c(idx[-1]-1, nrow(structure))
534 | g <- lapply(seq_along(s), function(i) {
535 |   x <- structure[s[i]:e[i],]
536 |   x$transcript <- i  
537 |   return(x)
538 | }) %>% do.call(rbind, .)
539 | g <- g[g$record == "exon",]
540 | g$transcript <- factor(g$transcript)
541 | 
542 | library(ggplot2)
543 | ggplot(g) + geom_segment(aes(x=start, xend=end, y=transcript, yend=transcript, color=transcript), size=5) + theme(legend.position="none") + labs(title="ANXA1")
544 | # 代码来源biobabble
545 | ```
546 | 
547 | ### reads覆盖图
548 | 
549 | 由于染色体的物理特性，某些区域的测序深度会明显高于其他部分。reads覆盖图用于探索不同read在不同区域的覆盖情况。 其实本身原理很简单，就是把全基因组的每个坐标的depth都得到，然后得到depth的频数，然后画图。
550 | 我们可以对每条染色体单独来绘图，也可以针对全基因组来绘图。这里使用是我们存放在data文件下的wgs.bam。 脚本很简单：
551 | ```shell
552 | samtools mpileup wgs.bam | perl -alne \ '{if($F[3]>100){$depth{"over100"}++}else{$depth{$F[3]}++}}END{print "$_\t$depth{$_}" foreach sort{$a <=> $b}keys %depth}' \
553 | > wgs.depth.txt
554 | ```
555 | 得到数据分为两列, 第一列是测序深度，第二列是在该测序深度下有多少个位点。因此第二列加起来就会是染色体的禅读。
556 | ```{r,eval=FALSE}
557 | a <- read.table('data/wgs.depth.txt', stringsAsFactors = F)
558 | p1 <- ggplot(a, aes(x=V1, y=V2)) + geom_line(lwd=2)
559 | p2 <- p1 + geom_vline(xintercept = 27) + xlab("测序深度") + ylab("位点数") 
560 | print(p2)
561 | ```
562 | 
563 | 
564 | ### 其它
565 | 
566 | 
567 | 
568 | 
569 | 
570 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/04-statistics_cache/html/__packages:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | base
 2 | ggplot2
 3 | corrplot
 4 | gpairs
 5 | sm
 6 | vioplot
 7 | tidyverse
 8 | tibble
 9 | tidyr
10 | readr
11 | purrr
12 | dplyr
13 | RColorBrewer
14 | BiocInstaller
15 | BiocGenerics
16 | Biobase
17 | affy
18 | CLL
19 | pheatmap
20 | limma
21 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/04-statistics_cache/html/transript-plot_7b7eb69dbb08857b9d487180ed1a4d06.RData:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_cache/html/transript-plot_7b7eb69dbb08857b9d487180ed1a4d06.RData


--------------------------------------------------------------------------------
/04-statistics_cache/html/transript-plot_7b7eb69dbb08857b9d487180ed1a4d06.rdb:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_cache/html/transript-plot_7b7eb69dbb08857b9d487180ed1a4d06.rdb


--------------------------------------------------------------------------------
/04-statistics_cache/html/transript-plot_7b7eb69dbb08857b9d487180ed1a4d06.rdx:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_cache/html/transript-plot_7b7eb69dbb08857b9d487180ed1a4d06.rdx


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/04-statistics_files/figure-html/circle-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/circle-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/cluster-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/cluster-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/density-plot-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/density-plot-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/density-plot-2.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/density-plot-2.png


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/04-statistics_files/figure-html/distribution-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/distribution-1.png


--------------------------------------------------------------------------------
/04-statistics_files/figure-html/gpairs-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/gpairs-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/heatmap-2-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/heatmap-2-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/heatmap-3-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/heatmap-3-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/heatmap1-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/heatmap1-1.png


--------------------------------------------------------------------------------
/04-statistics_files/figure-html/multi-plot-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/multi-plot-1.png


--------------------------------------------------------------------------------
/04-statistics_files/figure-html/transript-plot-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/transript-plot-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-1-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-1-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-10-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-10-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-2-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-2-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-3-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-3-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-6-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-6-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-7-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-7-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-8-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-8-1.png


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/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-9-1.png:
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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/04-statistics_files/figure-html/unnamed-chunk-9-1.png


--------------------------------------------------------------------------------
/07-appendix.Rmd:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | \cleardoublepage 
  2 | 
  3 | # (APPENDIX) 附录 {-}
  4 | 
  5 | # 编程实战题 {#action}
  6 | 
  7 | 列出我们板块的人气最旺的20个题目，作为第五章节学习后的复习题目。
  8 | 
  9 | #### [1.生信编程很简单](http://www.biotrainee.com/thread-834-1-1.html) {-}
 10 | 
 11 | ##### 编程语言系统入门 {-}
 12 | 
 13 | - [生信分析人员如何系统入门python?](https://mp.weixin.qq.com/s/073y_TDA2gcJVGrw0XBxMA)
 14 | - [生信分析人员如何系统入门perl？](http://mp.weixin.qq.com/s/lq6pSGtbZxbc0A6-ZLqaqQ)
 15 | - [生信分析人员如何系统入门R？](http://mp.weixin.qq.com/s/ouejcgJ0rLy7eBxNPRO50g)
 16 | - [生信分析人员如何系统入门Linux？](http://mp.weixin.qq.com/s/xWtUFG37WMTzA3c0PnCNtg)
 17 | 
 18 | ##### 题目 {-}
 19 | 
 20 | ###### 对FASTQ的操作 {-}
 21 | 
 22 | - 5,3段截掉几个碱基
 23 | - 序列长度分布统计
 24 | - FASTQ 转换成 FASTA
 25 | - 统计碱基个数及GC%
 26 | 
 27 | ###### 对FASTA的操作 {-}
 28 | 
 29 | - 取互补序列
 30 | - 取反向序列
 31 | - DNA to RNA
 32 | - 大小写字母形式输出
 33 | - 每行指定长度输出序列
 34 | - 按照序列长度/名字排序
 35 | - 提取指定ID的序列
 36 | - 随机抽取序列
 37 | 
 38 | ###### 高级难度 {-}
 39 | 
 40 | - 根据坐标取序列
 41 | - 多文件合并
 42 | - 根据ID列表取序列
 43 | - GTF文件探索
 44 | - 简并碱基的引物序列还原成多条序列
 45 | - snp进行注释并格式化输出
 46 | 
 47 | ##### 下载安装bowtie2（内含测试数据） {-}
 48 | 
 49 | ```
 50 | cd ~/biosoft
 51 | mkdir bowtie &&  cd bowtie
 52 | wget https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/2.2.9/bowtie2-2.2.9-linux-x86_64.zip  
 53 | unzip bowtie2-2.2.9-linux-x86_64.zip
 54 | ```
 55 | 
 56 | #### [2.人类基因组的外显子区域的长度](http://www.biotrainee.com/thread-3-1-1.html) {-}
 57 |  
 58 | ##### 题目 {-}
 59 | 
 60 | 下载人类外显子的坐标文件，编写代码统计外显子区域的长度。
 61 | 
 62 | ##### 测试数据 {-}
 63 | 
 64 | - Rbioconductor的TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene包
 65 | - NCBI数据库：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/CCDS/current_human/
 66 | 
 67 | ##### R实现代码示例 {-}
 68 | 
 69 | ```
 70 | rm(list=ls())
 71 | a=read.table(choose.files(),sep = '\t',stringsAsFactors = F,header = T) # 选择你下的CCDs文件
 72 | tmp <- apply(a[1:100,], 1, function(gene){ # 取前100行数据分析调试
 73 | # gene=a[3,]
 74 |   x=gene[10] # Column10 外显子坐标位置列
 75 |   if(grepl('\\]',x)){ # 判断x中是否存在有]这样的符号，如果有就利用正则替换掉。
 76 |     x=sub('\\[','',x)
 77 |     x=sub('\\]','',x)
 78 |     # 这个时候得到的对象还是像这样的“880073-880179, 880436-880525……”
 79 |     tmp <- strsplit(as.character(x),',')[[1]]# 我们先从逗号开始分割成小块
 80 |     start <- as.numeric(unlist(lapply(tmp,function(y){# 取开始位点
 81 |       strsplit(as.character(y),'-')[[1]][1]
 82 |     })))
 83 |     end <- as.numeric(unlist(lapply(tmp,function(y){ # 取结束位点
 84 |       strsplit(as.character(y),'-')[[1]][2]
 85 |     })))
 86 |     gene_d <- data.frame(gene=gene[3], # 将基因名，染色体，开始、结束位点绑定为数据框
 87 |                       chr=gene[1],
 88 |                       start=start,
 89 |                       end=end
 90 |     )
 91 |     return (gene_d)#返回数据框
 92 |   }
 93 | }) 
 94 | tmp_pos=c() # 构造一个空的向量
 95 | lapply(tmp[1:10], function(x){ # 取前10个list文件计算调试
 96 | # print(x)
 97 |   if ( !is.null(x)){
 98 |     apply(x, 1,function(y){
 99 |       #print(y)
100 |       for ( i in as.numeric(y[3]):as.numeric(y[4]) ) # y[3]为坐标起点，y[4]为终止坐标，历编
101 |         tmp_pos <<- c(tmp_pos,paste0(y[2],"-",i))
102 |     })
103 |     
104 |   }
105 | })
106 | length(tmp_pos) # 计算exon的长度
107 | length(unique(tmp_pos)) # 计算去重后的exon的长度
108 | ```
109 | 
110 | #### [3.hg19基因组序列的一些探究](http://www.biotrainee.com/thread-625-1-1.html) {-}
111 | 
112 | #####  题目 {-}
113 | 
114 | 求：hg19 每条染色体长度，每条染色体N的含量，GC含量。
115 | （高级作业：蛋白编码区域的GC含量会比基因组其它区域的高吗？ ）
116 | 
117 | #####  测试数据 {-}
118 | 
119 | - hg19基因组序列下载
120 | 
121 | ```
122 | wget http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/chromFa.tar.gz # 也可以在浏览器上下载
123 | tar xvzf chromFa.tar.gz
124 | cat *.fa > hg19.fa
125 | rm chr*.fa # 先把着急删，我待会可能要那他测试运行速度
126 | ```
127 | 
128 | - 简单测试数据
129 | 
130 | ```
131 | >chr_1
132 | ATCGTCGaaAATGAANccNNttGTA
133 | AGGTCTNAAccAAttGggG
134 | >chr_2
135 | ATCGAATGATCGANNNGccTA
136 | AGGTCTNAAAAGG
137 | >chr_3
138 | ATCGTCGANNNGTAATggGA
139 | AGGTCTNAAAAGG
140 | >chr_4
141 | ATCGTCaaaGANNAATGANGgggTA
142 | ```
143 | 
144 | ##### Perl代码示例 {-}
145 | 
146 | ###### 单行命令 {-}
147 | 
148 | ```
149 | perl -alne '{if(/^>/){$chr=$_}else{ $A_count{$chr}+=($_=~tr/Aa//); $T_count{$chr}+=($_=~tr/Tt//);$C_count{$chr}+=($_=~tr/Cc//); $G_count{$chr}+=($_=~tr/Gg//); $N_count{$chr}+=($_=~tr/Nn//); }}END{print "$_\t$A_count{$_}\t$T_count{$_}\t$C_count{$_}\t$G_count{$_}\t$N_count{$_}" foreach sort keys  %N_count}' test.fa 
150 | ```
151 | 
152 | ###### 完整代码 {-}
153 | 
154 | ```
155 | while (<>){
156 | chomp;
157 | if(/^>/){
158 | $chr=$_
159 | }
160 | else{ 
161 | $A_count{$chr}+=($_=~tr/Aa//);
162 | $T_count{$chr}+=($_=~tr/Tt//);
163 | $C_count{$chr}+=($_=~tr/Cc//); 
164 | $G_count{$chr}+=($_=~tr/Gg//);
165 | $N_count{$chr}+=($_=~tr/Nn//); 
166 | }
167 | } 
168 | foreach (sort keys  %N_count){
169 | $length = $A_count{$_}+$T_count{$_}+$C_count{$_}+$G_count{$_}+$N_count{$_};
170 | $gc = ($G_count{$_}+$C_count{$_})/($A_count{$_}+$T_count{$_}+$C_count{$_}+$G_count{$_});
171 | print "$_\t$A_count{$_}\t$T_count{$_}\t$C_count{$_}\t$G_count{$_}\t$N_count{$_}\t$length\t$gc\n" 
172 | }
173 | ```
174 | 
175 | ##### 参考结果{-}
176 | 
177 | 结果如下；
178 | ```
179 | >chr_1        13        10        7        10        4
180 | >chr_2        11        6        5        8        4
181 | >chr_3        10        6        3        10        4
182 | >chr_4        9        4        2        7        3
183 | ```
184 | 
185 | #### [4.hg38每条染色体的基因、转录本分布](http://www.biotrainee.com/thread-626-1-1.html) {-}
186 | 
187 | #####  题目 {-}
188 | 
189 | 对GTF注释文件进行探究，统计每条染色体基因数、转录本数、内含子数、外显子数。
190 | 
191 | 高级作业：下载[human/rat/mouse/dog/cat/chicken等物种的gtf注释文件](http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html) 编写函数实现对多个GTF文件进行批量统计染色体基因、转录本的分布及转录本外显子个数；
192 | 
193 | 继续探索回答以下问题：
194 | 
195 | - 所有基因平均有多少个转录本？
196 | - 所有转录本平均有多个exon和intron？
197 | - 如果要比较多个数据库呢（gencode/UCSC/NCBI？）？
198 | - 如果把基因分成多个类型呢？protein coding gene，pseudogene，lncRNA还有miRNA的基因？它们的特征又有哪些变化呢？
199 | 
200 | ##### 测试数据 {-}
201 | 
202 | ```
203 | wget -c ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.87.chr.gtf.gz
204 | gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.87.chr.gtf.gz
205 | ```
206 | 
207 | ##### 代码示例 {-}
208 | 
209 | ```
210 | # 每条染色体的基因个数
211 | zcat Homo_sapiens.GRCh38.87.chr.gtf.gz |perl -alne '{print if $F[2] eq "gene" }' |cut -f 1 |sort |uniq -c
212 | # 基因分类
213 | zcat Homo_sapiens.GRCh38.87.chr.gtf.gz |perl -alne '{next unless $F[2] eq "gene" ;/gene_biotype "(.*?)";/;print $1}'  |sort |uniq -c
214 | ```
215 | 
216 | #### [5.多个同样行列式文件的合并](http://www.biotrainee.com/thread-603-1-1.html) {-}
217 | 
218 | #####  题目 {-}
219 | 
220 | 将htseq-count生成的所有独立样本文件进行合并（每个样品对应一个文件，包括了所有基因表达量）。
221 | 希望通过编程处理每个文件得到输出的表达矩阵（行名是基因名，列名是样品名），如下所示：
222 | 
223 | ##### 模拟数据 {-}
224 | 
225 | 用perl脚本模仿htseq-count计算每个样本所有的基因表达量的输出独立样本文件：
226 | 
227 | ```
228 | ## 首先新建文件tmp.sh 输入这个代码：
229 | perl -le '{print "gene_$_\t".int(rand(1000)) foreach 1..99}'
230 | ## 然后用perl脚本调用这个tmp.sh文件：
231 | perl -e 'system(" bash tmp.sh >$_.txt") foreach a..z'
232 | ## 这样就生成了a~z这26个样本的counts文件
233 | ```
234 | 
235 | 第一列是基因，第二列是该基因的counts值，共有a~z这26个样本的counts文件，需要合并成一个大的行列式，这样才能导入到R里面做差异分析，如果手工用excel表格做，当然是可以的，但是太麻烦，如果有500个样本，正常人都不会去手工做了，需要编程。
236 | 
237 | **每个样本的基因顺序并不一致，这时候你应该怎么做呢？**
238 | 
239 | ##### 真实数据 {-}
240 | 
241 | 实际需求如下：[GSE48213](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48213)里面有56个文件，需要合并成一个表达矩阵，来根据cell-line的不同，分组做差异分析。可以查看[paper](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24176112 )
242 | 
243 | ```
244 | wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geo/series/GSE48nnn/GSE48213/suppl/GSE48213_RAW.tar
245 | tar -xf GSE48213_RAW.tar
246 | gzip -d *.gz
247 | ```
248 | 
249 | ##### 代码示例 {-}
250 | 
251 | ```
252 | ## 首先在GSE48213_RAW目录里面生成tmp.txt文件，使用shell脚本：
253 | awk '{print FILENAME"\t"$0}' * |grep -v EnsEMBL_Gene_ID >tmp.txt
254 | ## 然后把tmp.txt导入R语言里面用reshape2处理即可！
255 | setwd('tmp/GSE48213_RAW/')
256 | a=read.table('tmp.txt',sep = '\t',stringsAsFactors = F)
257 | library(reshape2)
258 | fpkm <- dcast(a,formula = V2~V1)
259 | ```
260 | 
261 | #### [6.根据GTF画基因的多个转录本结构](http://www.biotrainee.com/thread-624-1-1.html) {-}
262 | 
263 | #####  题目 {-}
264 | 
265 | 从NCBI,ENSEMBL,UCSC,GENCODE数据库下载各种GTF注释文件，编写代码得到所有基因的转录本个数，以及每个转录本的外显子的坐标，绘制如下转录本结构图：
266 | 
267 | > 比如对这个ANXA1基因来说，非常多的转录本，但是基因的起始终止坐标，是所有转录本起始终止坐标的极大值和极小值。同时，它是一个闭合基因，因为它存在一个转录本的起始终止坐标等于该基因的起始终止坐标。可以看到它的外显子并不是非常整齐的，虽然多个转录本会共享某些外显子，但是也存在某些外显子比同区域其它外显子长的现象。
268 | 
269 | ##### 测试数据 {-}
270 | 
271 | ```
272 | wget -c http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/sites/default/files/data/tools/rnaseqc/gencode.v7.annotation_goodContig.gtf.gz
273 | gzip -d gencode.v7.annotation_goodContig.gtf.gz
274 | ```
275 | 
276 | ##### R实现代码示例 {-}
277 | 
278 | ```
279 | rm(list=ls())
280 | 
281 | ## http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/sites/default/files/data/tools/rnaseqc/gencode.v7.annotation_goodContig.gtf.gz
282 | 
283 | setwd('tmp')
284 | gtf <- read.table('gencode.v7.annotation_goodContig.gtf.gz',stringsAsFactors = F,
285 |                   header = F,comment.char = "#",sep = '\t'
286 |                   )
287 | table(gtf[,2])
288 | gtf <- gtf[gtf[,2] =='HAVANA',]
289 | gtf <- gtf[grepl('protein_coding',gtf[,9]),]
290 | 
291 | lapply(gtf[1:10,9], function(x){
292 |   y=strsplit(x,';') 
293 | })
294 | 
295 | gtf$gene <- lapply(gtf[,9], function(x){
296 |   y <- strsplit(x,';')[[1]][5]
297 |   strsplit(y,'\\s')[[1]][3]
298 |   }
299 | )
300 | draw_gene = 'TP53'
301 | structure = gtf[gtf$gene==draw_gene,]
302 |   
303 | colnames(structure) =c(
304 |   'chr','db','record','start','end','tmp1','tmp2','tmp3','tmp4','gene'
305 | )
306 | gene_start <- min(c(structure$start,structure$end))
307 | gene_end <- max(c(structure$start,structure$end))
308 | tmp_min=min(c(structure$start,structure$end))
309 | structure$new_start=structure$start-tmp_min
310 | structure$new_end=structure$end-tmp_min
311 | tmp_max=max(c(structure$new_start,structure$new_end))
312 | num_transcripts=nrow(structure[structure$record=='transcript',])
313 | tmp_color=rainbow(num_transcripts)
314 | 
315 | x=1:tmp_max;y=rep(num_transcripts,length(x))
316 | #x=10000:17000;y=rep(num_transcripts,length(x))
317 | plot(x,y,type = 'n',xlab='',ylab = '',ylim = c(0,num_transcripts+1))
318 | title(main = draw_gene,sub = paste("chr",structure$chr,":",gene_start,"-",gene_end,sep=""))
319 | j=0;
320 | tmp_legend=c()
321 | for (i in 1:nrow(structure)){
322 |   tmp=structure[i,]
323 |   if(tmp$record == 'transcript'){
324 |     j=j+1
325 |     tmp_legend=c(tmp_legend,paste("chr",tmp$chr,":",tmp$start,"-",tmp$end,sep=""))
326 |   }
327 |   if(tmp$record == 'exon') lines(c(tmp$new_start,tmp$new_end),c(j,j),col=tmp_color[j],lwd=4)
328 | }
329 | ```
330 | 
331 | ##### 参考结果 {-}
332 | 
333 | 
334 | #### [7.下载最新版的KEGG信息，并且解析好](http://www.biotrainee.com/thread-672-1-1.html) {-}
335 | 
336 | #####  题目 {-}
337 | 
338 | 下载最新版的KEGG注释文本文件，编写脚本整理成kegg的pathway的ID与基因ID的对应格式。
339 | 
340 | ##### 测试数据 {-}
341 | 
342 | - 1 首先打开[KEGG官方网站](http://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html)，网页中展示出了各个物种的分类、拉丁名称、英文名称等信息。
343 | 
344 | 
345 | - 2 直接网页中搜索（Ctrl + F）需要下载的物种英文名称或拉丁名。如果不确定物种名称，网站中提供了详细的分类系统，也可根据前面的物种分类信息进行查找。
346 |   本文以拟南芥为例，搜索“Arabidopsis thaliana”即可找到。找到后点击物种名称前的3个字母缩写链接（下图红色框中的位置）。
347 | 
348 | 
349 | - 3 进入后的网页中包含了物种的一些基因组信息，点击上方的“Brite hierarchy”，进入后再点击“KEGG Orthology (KO)”；
350 | 
351 | 
352 | - 4 在跳转出的网页中点击“Download htext”，弹出下载窗口进行下载，国外网站有时会出现无法下载的情况，多试几次即可；
353 | 
354 | - 5 当然，下载好之后还没有结束。下载得到文本文件，可以看到里面的结构层次非常清楚，C开头的就是kegg的pathway的ID所在行，D开头的就是属于它的kegg的所有的基因。A,B是kegg的分类，总共是6个大类，42个小类。
355 | 
356 | 
357 | ##### Perl代码示例 {-}
358 | 
359 | ```
360 | perl -alne '{if(/^C/){/PATH:hsa(\d+)/;$kegg=$1}else{print "$kegg\t$F[1]" if /^D/ and $kegg;}}' hsa00001.keg >kegg2gene.txt
361 | ```
362 | 
363 | ##### 参考结果 {-}
364 | 
365 | 
366 | #### [8.写超几何分布检验](http://www.biotrainee.com/thread-749-1-1.html) {-}
367 | 
368 | #####  题目 {-}
369 | 
370 | 学习GO/KEGG的富集分析的原理，编写代码实现超几何分布检验，将得到的结果与测试数据中的kegg.enrichment.html进行比较。
371 | 
372 | (P值的计算：C(k,M)*C(n-k,N-M)/C(n,N) )
373 | 
374 | ##### 测试数据 {-}
375 | 
376 | - kegg2gene（第六讲kegg数据解析结果）
377 | 
378 | >暂时不用最新版的kegg注释数据，为了能够统一答案
379 | 
380 | - 差异基因list和背景基因list(R代码)
381 | 
382 | ```
383 | source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
384 | biocLite("org.Hs.eg.db")
385 | biocLite("KEGG.db")
386 | biocLite("GOstats")
387 | biocLite("hgu95av2.db")
388 | 
389 | library(org.Hs.eg.db)
390 | library(KEGG.db)
391 | library(GOstats)
392 | library("hgu95av2.db")
393 | 
394 | ##得到kegg2gene.list(KEGG注释信息)
395 | 
396 | tmp=toTable(org.Hs.egPATH)
397 | write.table(tmp,'kegg2gene.list.txt',quote = F,row.names = F)
398 | ## 得到universeGeneIds.txt(背景基因list)
399 | ls('package:hgu95av2.db')
400 | universeGeneIds <- unique(mappedRkeys(hgu95av2ENTREZID))
401 | write.table(universeGeneIds,'universeGeneIds.txt',quote = F,row.names = F)
402 | 
403 | ## 得到diff_gene.txt(差异基因list)
404 | 
405 | set.seed('123456.789')
406 | diff_gene = sample(universeGeneIds,300)
407 | write.table(diff_gene,'diff_gene.txt',quote = F,row.names = F)
408 | 
409 | ## 得到kegg.enrichment.html(富集分析结果)
410 | 
411 | annotationPKG='org.Hs.eg.db'
412 | hyperG.params = new("KEGGHyperGParams", geneIds=diff_gene, universeGeneIds=universeGeneIds, annotation=annotationPKG,
413 | categoryName="KEGG", pvalueCutoff=1, testDirection = "over")
414 | KEGG.hyperG.results = hyperGTest(hyperG.params);
415 | htmlReport(KEGG.hyperG.results, file="kegg.enrichment.html", summary.args=list("htmlLinks"=TRUE))
416 | 
417 | ```
418 | 
419 | ##### R代码示例 {-}
420 | 
421 | 下载链接： https://github.com/jmzeng1314/humanid/blob/master/R/hyperGtest_jimmy.R
422 | 
423 | ```
424 | library("hgu95av2.db")[/align][align=left]ls('package:hgu95av2.db')
425 | universeGeneIds <- unique(mappedRkeys(hgu95av2ENTREZID))
426 | set.seed('123456.789')
427 | diff_gene = sample(universeGeneIds,300)
428 | library(org.Hs.eg.db)
429 | library(KEGG.db)
430 | tmp=toTable(org.Hs.egPATH)
431 | GeneID2kegg<<- tapply(tmp[,2],as.factor(tmp[,1]),function(x) x)
432 | kegg2GeneID<<- tapply(tmp[,1],as.factor(tmp[,2]),function(x) x)
433 | #results <- hyperGtest_jimmy(GeneID2kegg,kegg2GeneID,diff_gene,universeGeneIds)
434 | 
435 | GeneID2Path=GeneID2kegg
436 | Path2GeneID=kegg2GeneID
437 | 
438 | diff_gene_has_path=intersect(diff_gene,names(GeneID2Path))
439 | n=length(diff_gene) #306
440 | N=length(universeGeneIds) #5870
441 | results=c()
442 | 
443 | for (i in names(Path2GeneID)){
444 |   #i="04672"
445 |   M=length(intersect(Path2GeneID[[i]],universeGeneIds))
446 |   #print(M)
447 |   
448 |   if(M<5)
449 |     next
450 |   exp_count=n*M/N
451 |   #print(paste(n,N,M,sep="\t"))
452 |   k=0
453 |   for (j in diff_gene_has_path){
454 |     if (i %in% GeneID2Path[[j]]) k=k+1
455 |   }
456 |   OddsRatio=k/exp_count
457 |   if (k==0) next
458 |   p=phyper(k-1,M, N-M, n, lower.tail=F)
459 |   #print(paste(i,p,OddsRatio,exp_count,k,M,sep="    "))
460 |   results=rbind(results,c(i,p,OddsRatio,exp_count,k,M))
461 | }
462 | colnames(results)=c("PathwayID","Pvalue","OddsRatio","ExpCount","Count","Size")
463 | results=as.data.frame(results,stringsAsFactors = F)
464 | results$p.adjust = p.adjust(results$Pvalue,method = 'BH')
465 | results=results[order(results$Pvalue),]
466 | rownames(results)=1:nrow(results)
467 | ```
468 | 
469 | #### [9.ID转换](http://www.biotrainee.com/thread-941-1-1.html)  {-}
470 | 
471 | #####  题目 {-}
472 | 
473 | probe_id，gene_id，gene_name, symbol之间的转换。
474 | 
475 | ##### 测试数据 {-}
476 | 
477 | - 需要转换的探针ID(变量my_probe)
478 | 
479 | ```
480 | rm(list=ls())
481 | library("hgu95av2.db")
482 | ls('package:hgu95av2.db')
483 | probe2entrezID=toTable(hgu95av2ENTREZID)
484 | probe2symbol=toTable(hgu95av2SYMBOL)
485 | probe2genename=toTable(hgu95av2GENENAME)
486 | 
487 | my_probe = sample(unique(mappedLkeys(hgu95av2ENTREZID)),30)
488 | 
489 | tmp1 = probe2symbol[match(my_probe,probe2symbol$probe_id),]
490 | tmp2 = probe2entrezID[match(my_probe,probe2entrezID$probe_id),]
491 | tmp3 = probe2genename[match(my_probe,probe2genename$probe_id),]
492 | 
493 | write.table(my_probe,'my_probe.txt',quote = F,col.names = F,row.names =F)
494 | write.table(tmp1$symbol,'my_symbol.txt',quote = F,col.names = F,row.names =F)
495 | write.table(tmp2$gene_id,'my_geneID.txt',quote = F,col.names = F,row.names =F)
496 | ```
497 | 
498 | - 下载对应关系
499 |   ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/ 
500 | - illumina芯片的探针
501 | 
502 | > 所有bioconductor支持的芯片平台对应关系：通过bioconductor包来获取所有的芯片探针与gene的对应关系；可以从NCBI的GPL平台下载：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL6947；也可以直接加载对应的包；或者直接去公司的主页下载manifest文件。
503 | 
504 | 
505 | ```
506 | library("illuminaHumanv4.db")
507 | ls('package:illuminaHumanv4.db')
508 | 
509 | probe2entrezID=toTable(illuminaHumanv4ENTREZID)
510 | probe2symbol=toTable(illuminaHumanv4SYMBOL)
511 | probe2genename=toTable(illuminaHumanv4GENENAME)
512 | 
513 | my_probe = sample(unique(mappedLkeys(illuminaHumanv4ENTREZID)),30)
514 | 
515 | probe2symbol[match(my_probe,probe2symbol$probe_id),]
516 | probe2entrezID[match(my_probe,probe2entrezID$probe_id),]
517 | probe2genename[match(my_probe,probe2genename$probe_id),]
518 | 
519 | ```
520 | 
521 | ##### R代码示例
522 | 
523 | 基因的转换：运行下面的R代码，得到的my_symbol_gene和my_entrez_gene就是需要转换的ID。
524 | 
525 | ```
526 | library("illuminaHumanv4.db")
527 | ls('package:illuminaHumanv4.db')
528 | my_entrez_gene = sample(unique(mappedRkeys(illuminaHumanv4ENTREZID)),30)
529 | my_symbol_gene = sample(unique(mappedRkeys(illuminaHumanv4SYMBOL)),30)
530 | 
531 | library("org.Hs.eg.db")
532 | ls('package:org.Hs.eg.db')
533 | 
534 | entrezID2symbol <- toTable(org.Hs.egSYMBOL)
535 | 
536 | entrezID2symbol[match(my_entrez_gene,entrezID2symbol$gene_id),]
537 | entrezID2symbol[match(my_symbol_gene,entrezID2symbol$symbol),]
538 | ```
539 | 
540 | 
541 | #### [10.根据指定染色体及坐标得到序列](http://www.biotrainee.com/thread-666-1-1.html)
542 | 
543 | #####  题目 {-}
544 | 
545 | 参考基因组hg19，指定染色体及坐标"chr5","8397384"，编写程序得到这个坐标以及它上下一个碱基。（机器无法计算hg19，则使用测试数据，指定坐标是 3号染色体的第6个碱基。）
546 | 
547 | ##### 测试数据 {-}
548 | 
549 | ```
550 | >chr_1
551 | ATCGTCGaaAATGAANccNNttGTA
552 | AGGTCTNAAccAAttGggG
553 | >chr_2
554 | ATCGAATGATCGANNNGccTA
555 | AGGTCTNAAAAGG
556 | >chr_3
557 | ATCGTCGANNNGTAATggGA
558 | AGGTCTNAAAAGG
559 | >chr_4
560 | ATCGTCaaaGANNAATGANGgggTA
561 | ```
562 | 
563 | #### [11.根据指定染色体及坐标得到位置信息](http://www.biotrainee.com/thread-863-1-2.html) {-}
564 | 
565 | #####  题目 {-}
566 | 
567 | 基因的chr,start,end都是已知的（坐标是hg38系统），任意给定基因组的chr:pos(chr1:2075000-2930999), 判断该区间在哪个基因上面？（可用现成软件bedtools）
568 | 
569 | ##### 测试数据 {-}
570 | 
571 | ```
572 | chr7        148697841        148698941
573 | chr7        148698942        148699029
574 | chr7        148699911        148701053
575 | chr7        148701109        148701307
576 | chr7        148701354        148702694
577 | chr7        148703100        148703520
578 | chr7        148703831        148704175
579 | chr7        148704484        148704734
580 | chr7        148704857        148705937
581 | chr7        148706271        148706671
582 | ```
583 | 
584 | 
585 | #### [12.把文件内容按照染色体分开写出](http://www.biotrainee.com/thread-1329-1-1.html) {-}
586 | 
587 | #####  题目 {-}
588 | 
589 | 根据染色体把文件拆分成1~22和其它染色体的两个文件呢？
590 | 
591 | ##### 测试数据 {-}
592 | 
593 | ```
594 | wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/CCDS/current_human/CCDS.current.txt
595 | ```
596 | 把文件改成bed格式，如下：
597 | ```
598 | chr2    43995310    43995986
599 | chr17  49788603    49789067
600 | chr17  59565573    59566163
601 | chr19  8390308 8390745
602 | chr12  49188033    49189033
603 | chr7    974903  975570
604 | chr7    98878532    98879500
605 | chr7    44044672    44045322
606 | chr1    153634052  153634772
607 | chr11  60905850    60906575
608 | ```
609 | 
610 | ##### Perl代码示例 {-}
611 | 
612 | ```
613 | use FileHandle;
614 | foreach( 1..22 ){
615 |     $normal_chr{"chr".$_}=1 ;
616 |     open $fh{"chr".$_},">chr$_.txt" or die;
617 | }
618 | open other,">chr_other.txt" or die;
619 | open FH,'a.bed';
620 | while(<FH>){
621 |     chomp;
622 |     @F=split;
623 |     if(exists $normal_chr{$F[0]}){
624 |         $fh{$F[0]}->print( "$_\n" );
625 |     }else{ 
626 |         print other $_;
627 |     }
628 | }
629 | foreach( 1..22 ){ 
630 |     close $fh{$_};
631 | }
632 | close other;
633 | ```
634 | 
635 | #### [13.JSON格式数据的格式化](http://www.biotrainee.com/thread-1355-1-1.html) {-}
636 | 
637 | #####  题目 {-}
638 | 
639 | 学习json格式，下载测试数据，从该json文件里面提取：technique factor target principal_investigator submission label category type Developmental-Stage organism key这几列信息。
640 | 
641 | ##### 测试数据 {-}
642 | 
643 | http://biotrainee.com/jbrowse/JBrowse-1.12.1/sample_data/json/modencode/modencodeMetaData.json
644 | 
645 | ##### Perl代码示例 {-}
646 | 
647 | ```
648 | #!/usr/bin/env perl
649 | use strict;
650 | use warnings;
651 | use autodie ':all';
652 | use 5.10.0;
653 | 
654 | use JSON 2;
655 | 
656 | my $data = from_json( do { local $/; open my $f, '<', $ARGV[0]; scalar <$f> } );
657 | 
658 | my @fields = qw( technique factor target principal_investigator submission label category type Developmental-Stage organism key );
659 | 
660 | say join ',', map "\"$_\"", @fields;
661 | 
662 | for my $item ( @{$data->{items}} ) {
663 |     $item->{key} = $item->{label};
664 |     no warnings 'uninitialized';
665 |     for my $track ( @{$item->{Tracks}} ) {
666 |         $item->{label} = $track;
667 |         say join ',', map "\"$_\"", @{$item}{@fields};
668 |     }
669 | }
670 | ```
671 | 
672 | ##### 参考结果 {-}
673 | 
674 | 完成之后的结果应该是：http://biotrainee.com/jbrowse/JBrowse-1.12.1/sample_data/json/modencode/modencodeMetaData.csv
675 | 
676 | 
677 | #### [14.多个探针对应一个基因，取平均值、最大值](http://www.biotrainee.com/thread-2077-1-1.html ) {-}
678 | 
679 | 
680 | #####  题目 {-}
681 | 
682 | 编写脚本对多个探针对应一个基因，取平均值、最大值。
683 | 
684 | ##### 测试数据 {-}
685 | 
686 | R里面的包自带很多芯片表达数据，所以测试数据就在下面的R代码里面
687 | 
688 | ##### R代码示例 {-}
689 | 
690 | ```
691 | # 平均值
692 | BiocInstaller::biocLite('CLL')
693 | BiocInstaller::biocLite('hgu95av2.db')
694 | 
695 | library('hgu95av2.db')
696 | library(CLL)
697 | data(sCLLex)
698 | sCLLex=sCLLex[,1:8] ## 样本太多，我就取前面8个
699 | group_list=sCLLex$Disease
700 | exprSet=exprs(sCLLex)
701 | exprSet=as.data.frame(exprSet)
702 | exprSet$probe_id=rownames(exprSet)
703 | head(exprSet)
704 | probe2symbol=toTable(hgu95av2SYMBOL)
705 | dat=merge(exprSet,probe2symbol,by='probe_id')
706 | results=t(sapply(split(dat,dat$symbol),function(x) colMeans(x[,1:(ncol(x)-1)])))
707 | 
708 | ```
709 | 
710 | #### [15.把counts矩阵转换成RPKM矩阵](http://www.biotrainee.com/thread-1791-1-1.html ) {-}
711 | 
712 | #####  题目 {-}
713 | 
714 | 编写脚本将hisat2+htseq-counts之后得到reads的counts矩阵转换成RPKM矩阵。
715 | 
716 | ##### 测试数据 {-}
717 | 
718 | ```
719 | wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/CCDS/current_mouse/CCDS.current.txt
720 | grep -v '^#' CCDS.current.txt | perl -alne '{/\[(.*?)\]/;$len=0;foreach(split/,/,$1){@tmp=split/-/;$len+=($tmp[1]-$tmp[0])};$h{$F[2]}=$len if $len >$h{$F[2]}} END{print "$_\t$h{$_}" foreach sort keys %h}' >mm10_ccds_length.txt
721 | ```
722 | 
723 | ##### R代码示例 {-}
724 | 
725 | ```
726 | genes_len=read.table("mm10_ccds_length.txt",stringsAsFactors=F)
727 | head(genes_len)
728 |               V1    V2
729 | 1      -343C11.2  1139
730 | 2 00R_AC107638.2  1060
731 | 3      00R_Pgap2  1676
732 | 4  0610005C13Rik  7363
733 | 5  0610006L08Rik 34995
734 | 6  0610007P14Rik  9074
735 | 
736 |   
737 | colnames(genes_len)<- c("GeneName","Len")
738 | 
739 |  head(exprSet)
740 |               GSM860181_priSG-A GSM860182_SG-A GSM860183_SG-B GSM860184_lepSC
741 | 00R_AC107638.2                0              1              0              1
742 | 0610005C13Rik                20            22            11              27
743 | 0610006L08Rik                  0              0              0              2
744 | 0610007P14Rik              2075          1785          1269            1430
745 | 0610009B22Rik                256            376            300            386
746 | 0610009E02Rik                22            22            16              28
747 |   
748 | exprSet<-exprSet[ rownames(exprSet) %in% genes_len$GeneName ,]
749 | 
750 | total_count<- colSums(exprSet)
751 | 
752 | neededGeneLength=genes_len[  match(rownames(exprSet), genes_len$GeneName) ,2] 
753 |   
754 | rpkm <- t(do.call( rbind,lapply(1:length(total_count),function(i){
755 |         10^9*exprSet[,i]/neededGeneLength/total_count[i]
756 | }) ))
757 | head(rpkm)
758 | rownames(rpkm)=rownames(exprSet)
759 | colnames(rpkm)=colnames(exprSet)
760 | 
761 | write.table(rpkm,file="rpkm.txt",sep="\t",quote=F)
762 | 
763 |   
764 |   
765 | library(TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene)
766 | txdb=TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene
767 | gt=transcriptsBy(txdb,by="gene")
768 | lapply(gt[1:40],function(x) max(width(x)))
769 | library(org.Mm.eg.db)
770 | 
771 | mykeys=
772 | columns(txdb);keytypes(txdb)
773 | neededcols <- c("GENEID", "TXSTRAND", "TXCHROM")
774 | select(txdb, keys=mykeys, columns=neededcols, keytype="TXNAME")
775 | ```
776 | 
777 | ##### 参考结果 {-}
778 | 
779 | #### [16.对有临床信息的表达矩阵批量做生存分析](http://www.biotrainee.com/thread-929-1-1.html) {-}
780 | 
781 | #####  题目 {-}
782 | 
783 | 使用R实现生存分析：
784 | 用```my.surv <- surv(OS_MONTHS,OS_STATUS=='DECEASED')```构建生存曲线；
785 | 用```kmfit2 <- survfit(my.surv~TUMOR_STAGE_2009)```来做某一个因子的KM生存曲线；
786 | 用```survdiff(my.surv~type, data=dat)```来看看这个因子的不同水平是否有显著差异，其中默认用是的logrank test 方法；
787 | 用```coxph(Surv(time, status) ~ ph.ecog + tt(age), data=lung) ```来检测自己感兴趣的因子是否受其它因子(age,gender等等)的影响。
788 | 
789 | ##### 代码示例 {-}
790 | 
791 | ```
792 | rm(list=ls())
793 | ## 50 patients and 200 genes 
794 | dat=matrix(rnorm(10000,mean=8,sd=4),nrow = 200)
795 | rownames(dat)=paste0('gene_',1:nrow(dat))
796 | colnames(dat)=paste0('sample_',1:ncol(dat))
797 | os_years=abs(floor(rnorm(ncol(dat),mean = 50,sd=20)))
798 | os_status=sample(rep(c('LIVING','DECEASED'),25))
799 | 
800 | library(survival)
801 | my.surv <- Surv( os_years,os_status=='DECEASED')
802 | ## The status indicator, normally 0=alive, 1=dead. Other choices are TRUE/FALSE (TRUE = death) or 1/2 (2=death). 
803 | ## And most of the time we just care about the time od DECEASED . 
804 | 
805 | fit.KM=survfit(my.surv~1)
806 | fit.KM
807 | plot(fit.KM)
808 | 
809 | log_rank_p <- apply(dat, 1, function(values1){
810 |   group=ifelse(values1>median(values1),'high','low')
811 |   kmfit2 <- survfit(my.surv~group)
812 |   #plot(kmfit2)
813 |   data.survdiff=survdiff(my.surv~group)
814 |   p.val = 1 - pchisq(data.survdiff$chisq, length(data.survdiff$n) - 1)
815 | })
816 | names(log_rank_p[log_rank_p<0.05])
817 | 
818 | gender= ifelse(rnorm(ncol(dat))>1,'male','female')
819 | age=abs(floor(rnorm(ncol(dat),mean = 50,sd=20)))
820 | ## gender and age are similar with group(by gene expression)
821 | 
822 | cox_results <- apply(dat , 1, function(values1){
823 |   group=ifelse(values1>median(values1),'high','low')
824 |   survival_dat <- data.frame(group=group,gender=gender,age=age,stringsAsFactors = F)
825 |   m=coxph(my.surv ~ age + gender + group, data =  survival_dat)
826 |   
827 |   beta <- coef(m)
828 |   se <- sqrt(diag(vcov(m)))
829 |   HR <- exp(beta)
830 |   HRse <- HR * se
831 |   
832 |   #summary(m)
833 |   tmp <- round(cbind(coef = beta, se = se, z = beta/se, p = 1 - pchisq((beta/se)^2, 1),
834 |                     HR = HR, HRse = HRse,
835 |                     HRz = (HR - 1) / HRse, HRp = 1 - pchisq(((HR - 1)/HRse)^2, 1),
836 |                     HRCILL = exp(beta - qnorm(.975, 0, 1) * se),
837 |                     HRCIUL = exp(beta + qnorm(.975, 0, 1) * se)), 3)
838 |   return(tmp['grouplow',])
839 |   
840 | })
841 | cox_results[,cox_results[4,]<0.05]
842 | ```
843 | 
844 | PS: 里面的os_years应该修改为os_month，因为总的生存期不应该长达几十年，而且因为ag和os_years都是随机生成的，可能会出现很不符合自然科学的现象。但是这个是模拟数据，请大家不用较真。
845 | 
846 | ####  [17.对多个差异分析结果直接取交集并集](http://www.biotrainee.com/thread-1288-1-2.html) {-}
847 | 
848 | #####  题目 {-}
849 | 
850 | 编写脚本对每两个差异分析结果计算基因交集个数与基因并集个数的比值，得到一个比值矩阵。
851 | 
852 | ##### 测试数据 {-}
853 | 
854 | 用perl单行命令模拟数据：
855 | 
856 | ```
857 | perl -e 'BEGIN{use List::Util qw/shuffle/;@gene=A..Z}{foreach(1..10){@this_genes=@gene[(shuffle(0..25))[0..int(rand(20))+4]];print "comparison_$_ <-  ";print join(";",@this_genes);print "\n"}}'
858 | ```
859 | 
860 | 总共10次差异分析，每次差异分析得到的差异基因在同一行的后面用大小字母表示。
861 | 
862 | ```
863 | comparison_1 -> I;G;E;V;C;K;B;W
864 | comparison_2 -> G;E;N;H;Y;M;L;S;K;A;J;O;D;P;R;U;Q;F;Z;C
865 | comparison_3 -> Y;V;U;N;H;K;I;P;S;F;D;X;G;C;Z;J;Q;T;W;O;E;M
866 | comparison_4 -> N;T;K;B;H;Z;W;C;Q;I;V;F;D;S;R;Y;J;X;P;O;G;L;A
867 | comparison_5 -> G;J;A;H;W;T;Z;E;Y;S;R
868 | comparison_6 -> Z;M;D;R;P;G;L;W;Y;U;X;E;A;S;T;I;H
869 | comparison_7 -> H;Z;T;O;W;Q;M;X;J;N;U;K;F;P;I;C;S;Y;A;B
870 | comparison_8 -> A;R;L;T;W;Q;S;F;P;X;E;V;Y;G;K;J;Z;C
871 | comparison_9 -> J;X;K;D;O;H;L;F;C;P;R;N
872 | comparison_10 -> G;S;K;H;C;O;W;F;Q;X
873 | ```
874 | 
875 | ##### R代码示例 {-}
876 | 
877 | ```
878 | a=readLines('test.txt')
879 | n=unlist(lapply(a , function(x){
880 |   trimws(strsplit(x,'<-')[[1]][1])
881 | }))
882 | v=lapply(a , function(x){
883 |   trimws(strsplit(trimws(strsplit(x,'<-')[[1]][2]),';')[[1]])
884 | })
885 | names(v)=n
886 | tmp=unlist(lapply(v, function(x){
887 |   lapply(v, function(y){
888 |     p1=length(intersect(x,y))
889 |     p2=length(union(x,y))
890 |     return(p1/p2)
891 |   })
892 | }))
893 | out=matrix(tmp,nrow = length(n))
894 | rownames(out)=n
895 | colnames(out)=n
896 | out[1:5,1:5]
897 | ```
898 | 
899 | ##### 参考结果 {-}
900 | 
901 | 结果的前五行如下：
902 | 
903 | ```
904 | comparison_1 comparison_2 comparison_3 comparison_4 comparison_5
905 | comparison_1    1.0000000    0.1666667    0.3043478    0.2916667    0.1875000
906 | comparison_2    0.1666667    1.0000000    0.6800000    0.6538462    0.4090909
907 | comparison_3    0.3043478    0.6800000    1.0000000    0.7307692    0.3750000
908 | comparison_4    0.2916667    0.6538462    0.7307692    1.0000000    0.4166667
909 | comparison_5    0.1875000    0.4090909    0.3750000    0.4166667    1.0000000
910 | ```
911 | 
912 | #### [18.根据GTF格式的基因注释文件得到人所有基因的染色体坐标](http://www.biotrainee.com/thread-472-1-1.html ) {-}
913 | 
914 | #####  题目 {-}
915 | 
916 | 从gencode数据库里面可以下载所有的gtf文件，编写脚本得到基因的染色体、起始终止坐标如下：
917 | 
918 | ```
919 | [jianmingzeng@gencode]$ head protein_coding.hg19.position 
920 | chr1        69091        70008        OR4F5
921 | chr1        367640        368634        OR4F29
922 | chr1        621096        622034        OR4F16
923 | chr1        859308        879961        SAMD11
924 | chr1        879584        894689        NOC2L
925 | chr1        895967        901095        KLHL17
926 | chr1        901877        911245        PLEKHN1
927 | chr1        910584        917473        PERM1
928 | chr1        934342        935552        HES4
929 | chr1        936518        949921        ISG15
930 | [jianmingzeng@gencode]$ head protein_coding.hg38.position 
931 | chr1        69091        70008        OR4F5
932 | chr1        182393        184158        FO538757.2
933 | chr1        184923        200322        FO538757.1
934 | chr1        450740        451678        OR4F29
935 | chr1        685716        686654        OR4F16
936 | chr1        923928        944581        SAMD11
937 | chr1        944204        959309        NOC2L
938 | chr1        960587        965715        KLHL17
939 | chr1        966497        975865        PLEKHN1
940 | chr1        975204        982093        PERM1
941 | ```
942 | 
943 | 
944 | # 名词解释 {#glossary}
945 | 
946 | 包括测序相关，组学相关的，给第1,6章节作补充。
947 | 
948 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/LICENSE:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | MIT License
 2 | 
 3 | Copyright (c) 2016 Yihui Xie
 4 | 
 5 | Permission is hereby granted, free of charge, to any person obtaining a copy
 6 | of this software and associated documentation files (the "Software"), to deal
 7 | in the Software without restriction, including without limitation the rights
 8 | to use, copy, modify, merge, publish, distribute, sublicense, and/or sell
 9 | copies of the Software, and to permit persons to whom the Software is
10 | furnished to do so, subject to the following conditions:
11 | 
12 | The above copyright notice and this permission notice shall be included in all
13 | copies or substantial portions of the Software.
14 | 
15 | THE SOFTWARE IS PROVIDED "AS IS", WITHOUT WARRANTY OF ANY KIND, EXPRESS OR
16 | IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE WARRANTIES OF MERCHANTABILITY,
17 | FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE AND NONINFRINGEMENT. IN NO EVENT SHALL THE
18 | AUTHORS OR COPYRIGHT HOLDERS BE LIABLE FOR ANY CLAIM, DAMAGES OR OTHER
19 | LIABILITY, WHETHER IN AN ACTION OF CONTRACT, TORT OR OTHERWISE, ARISING FROM,
20 | OUT OF OR IN CONNECTION WITH THE SOFTWARE OR THE USE OR OTHER DEALINGS IN THE
21 | SOFTWARE.
22 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/README.md:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | # 生物信息学最佳实践之基础篇
 2 | 
 3 | > 我第一次用**bookdown**写作，中间可能会有很多地方需要查手册，所以把 [**bookdown** 官方文档](https://bookdown.org/yihui/bookdown)放在这里以备不时之需。
 4 | 
 5 | 本来是不太愿意花时间整理这些太基础的知识点。但最近带领一个实验室湿实验工作者转行学习生物信息学的时候，他总是问我第一步该做什么！
 6 | 
 7 | 我回答他应该先了解一下测序原理，再了解一些常见的生物信息学格式，最后再学几个基础编程语言。
 8 | 
 9 | 他追问道：测序原理哪里去看呢？常见的生物信息学格式有哪些，我是不是应该买一本书呢？
10 | 
11 | 我才赫然发现，生物信息学领域居然没有这样一本小白文，方便湿实验工作者转行学习生物信息学的枕边书，既然缺乏，那我就做这个补充吧。
12 | 
13 | ## 关于作者 
14 | 
15 | > * [我的博客](http://www.bio-info-trainee.com/)
16 |  * [我们的论坛](http://www.biotrainee.com/forum.php)
17 |  * [捐赠我](http://www.bio-info-trainee.com/donate)
18 | 
19 | 我本人将会负责全书整体框架的搭建已经目录的设置，然后会适当引入两三位朋友跟我共同完成此书。所有的作者都会在这里列出：
20 | 
21 | 
22 | 
23 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/_bookdown.yml:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | book_filename: bookdown
 2 | clean: [packages.bib, bookdown.bbl]
 3 | language:
 4 |   label:
 5 |     fig: "图 "
 6 |     tab: "表 "
 7 |   ui:
 8 |     edit: "编辑"
 9 |     chapter_name: ["第 ", " 章"]
10 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/_bookdown_files/.DS_Store:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/_bookdown_files/.DS_Store


--------------------------------------------------------------------------------
/_bookdown_files/bookdown_cache/html/__packages:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | base
 2 | methods
 3 | datasets
 4 | utils
 5 | grDevices
 6 | graphics
 7 | stats
 8 | parallel
 9 | BiocGenerics
10 | stats4
11 | S4Vectors
12 | IRanges
13 | GenomeInfoDb
14 | GenomicRanges
15 | XVector
16 | Biostrings
17 | Rsamtools
18 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/_bookdown_files/bookdown_cache/html/unnamed-chunk-3_122250166c65120c0b46b832793f095b.RData:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/_bookdown_files/bookdown_cache/html/unnamed-chunk-3_122250166c65120c0b46b832793f095b.RData


--------------------------------------------------------------------------------
/_bookdown_files/bookdown_cache/html/unnamed-chunk-3_122250166c65120c0b46b832793f095b.rdb:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/_bookdown_files/bookdown_cache/html/unnamed-chunk-3_122250166c65120c0b46b832793f095b.rdb


--------------------------------------------------------------------------------
/_bookdown_files/bookdown_cache/html/unnamed-chunk-3_122250166c65120c0b46b832793f095b.rdx:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/_bookdown_files/bookdown_cache/html/unnamed-chunk-3_122250166c65120c0b46b832793f095b.rdx


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/_bookdown_files/bookdown_files/.DS_Store:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/_bookdown_files/bookdown_files/.DS_Store


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--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/_bookdown_files/bookdown_files/figure-latex/hello-1.pdf


--------------------------------------------------------------------------------
/_output.yml:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | bookdown::gitbook:
 2 |   css: css/style.css
 3 |   config:
 4 |     toc:
 5 |       collapse: none
 6 |       before: |
 7 |         <li><a href="./">中文书示例</a></li>
 8 |       after: |
 9 |         <li><a href="https://bookdown.org" target="blank">本书由 bookdown 强力驱动</a></li>
10 |     download: [pdf, epub]
11 |     edit: https://github.com/yihui/bookdown-chinese/edit/master/%s
12 |     sharing:
13 |       github: yes
14 |       facebook: no
15 | bookdown::pdf_book:
16 |   includes:
17 |     in_header: latex/preamble.tex
18 |     before_body: latex/before_body.tex
19 |     after_body: latex/after_body.tex
20 |   keep_tex: yes
21 |   dev: "cairo_pdf"
22 |   latex_engine: xelatex
23 |   citation_package: natbib
24 |   template: template.tex
25 |   pandoc_args: --chapters
26 |   toc_depth: 3
27 |   toc_unnumbered: no
28 |   toc_appendix: yes
29 |   quote_footer: ["\\begin{flushright}", "\\end{flushright}"]
30 | bookdown::epub_book:
31 |   stylesheet: css/style.css
32 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/author.html:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | <!DOCTYPE html>
  2 | <html >
  3 | 
  4 | <head>
  5 | 
  6 |   <meta charset="UTF-8">
  7 |   <meta http-equiv="X-UA-Compatible" content="IE=edge">
  8 |   <title></title>
  9 |   <meta name="description" content="">
 10 |   <meta name="generator" content="bookdown 0.4 and GitBook 2.6.7">
 11 | 
 12 |   <meta property="og:title" content="" />
 13 |   <meta property="og:type" content="book" />
 14 |   
 15 |   
 16 |   
 17 |   
 18 | 
 19 |   <meta name="twitter:card" content="summary" />
 20 |   <meta name="twitter:title" content="" />
 21 |   
 22 |   
 23 |   
 24 | 
 25 | 
 26 | 
 27 | 
 28 |   <meta name="viewport" content="width=device-width, initial-scale=1">
 29 |   <meta name="apple-mobile-web-app-capable" content="yes">
 30 |   <meta name="apple-mobile-web-app-status-bar-style" content="black">
 31 |   
 32 |   
 33 | 
 34 | 
 35 | <script src="libs/jquery-2.2.3/jquery.min.js"></script>
 36 | <link href="libs/gitbook-2.6.7/css/style.css" rel="stylesheet" />
 37 | <link href="libs/gitbook-2.6.7/css/plugin-bookdown.css" rel="stylesheet" />
 38 | <link href="libs/gitbook-2.6.7/css/plugin-highlight.css" rel="stylesheet" />
 39 | <link href="libs/gitbook-2.6.7/css/plugin-search.css" rel="stylesheet" />
 40 | <link href="libs/gitbook-2.6.7/css/plugin-fontsettings.css" rel="stylesheet" />
 41 | 
 42 | 
 43 | 
 44 | 
 45 | 
 46 | 
 47 | 
 48 | 
 49 | 
 50 | 
 51 | <link rel="stylesheet" href="css\style.css" type="text/css" />
 52 | </head>
 53 | 
 54 | <body>
 55 | 
 56 | 
 57 | 
 58 |   <div class="book without-animation with-summary font-size-2 font-family-1" data-basepath=".">
 59 | 
 60 |     <div class="book-summary">
 61 |       <nav role="navigation">
 62 | 
 63 | <ul class="summary">
 64 | <li><a href="./">中文书示例</a></li>
 65 | 
 66 | <li class="divider"></li>
 67 | <li class="chapter" data-level="" data-path=""><a href="#author"><i class="fa fa-check"></i>作者简介</a></li>
 68 | <li class="divider"></li>
 69 | <li><a href="https://bookdown.org" target="blank">本书由 bookdown 强力驱动</a></li>
 70 | 
 71 | </ul>
 72 | 
 73 |       </nav>
 74 |     </div>
 75 | 
 76 |     <div class="book-body">
 77 |       <div class="body-inner">
 78 |         <div class="book-header" role="navigation">
 79 |           <h1>
 80 |             <i class="fa fa-circle-o-notch fa-spin"></i><a href="./"></a>
 81 |           </h1>
 82 |         </div>
 83 | 
 84 |         <div class="page-wrapper" tabindex="-1" role="main">
 85 |           <div class="page-inner">
 86 | 
 87 |             <section class="normal" id="section-">
 88 | <!--bookdown:title:end-->
 89 | <!--bookdown:title:start-->
 90 | <div id="author" class="section level1 unnumbered">
 91 | <h1>作者简介</h1>
 92 | <blockquote>
 93 | <p>先放在这里</p>
 94 | </blockquote>
 95 | <ul>
 96 | <li><a href="http://www.bio-info-trainee.com/">我的博客</a></li>
 97 | <li><a href="http://www.biotrainee.com/forum.php">我们的论坛</a></li>
 98 | <li><a href="http://www.bio-info-trainee.com/donate">捐赠我</a></li>
 99 | </ul>
100 | </div>
101 |             </section>
102 | 
103 |           </div>
104 |         </div>
105 |       </div>
106 | 
107 | 
108 |     </div>
109 |   </div>
110 | <script src="libs/gitbook-2.6.7/js/app.min.js"></script>
111 | <script src="libs/gitbook-2.6.7/js/lunr.js"></script>
112 | <script src="libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-search.js"></script>
113 | <script src="libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-sharing.js"></script>
114 | <script src="libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-fontsettings.js"></script>
115 | <script src="libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-bookdown.js"></script>
116 | <script src="libs/gitbook-2.6.7/js/jquery.highlight.js"></script>
117 | <script>
118 | require(["gitbook"], function(gitbook) {
119 | gitbook.start({
120 | "sharing": {
121 | "github": true,
122 | "facebook": false,
123 | "twitter": true,
124 | "google": false,
125 | "weibo": false,
126 | "instapper": false,
127 | "vk": false,
128 | "all": ["facebook", "google", "twitter", "weibo", "instapaper"]
129 | },
130 | "fontsettings": {
131 | "theme": "white",
132 | "family": "sans",
133 | "size": 2
134 | },
135 | "edit": {
136 | "link": "https://github.com/yihui/bookdown-chinese/edit/master/%s",
137 | "text": "缂栬緫"
138 | },
139 | "download": null,
140 | "toc": {
141 | "collapse": "none"
142 | },
143 | "search": false
144 | });
145 | });
146 | </script>
147 | 
148 | </body>
149 | 
150 | </html>
151 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/basic.Rproj:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | Version: 1.0
 2 | 
 3 | RestoreWorkspace: Default
 4 | SaveWorkspace: Default
 5 | AlwaysSaveHistory: Default
 6 | 
 7 | EnableCodeIndexing: Yes
 8 | UseSpacesForTab: Yes
 9 | NumSpacesForTab: 2
10 | Encoding: UTF-8
11 | 
12 | RnwWeave: Sweave
13 | LaTeX: pdfLaTeX
14 | 
15 | BuildType: Website
16 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/book.bib:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | @Book{xie2015,
 2 |   title = {Dynamic Documents with {R} and knitr},
 3 |   author = {Yihui Xie},
 4 |   publisher = {Chapman and Hall/CRC},
 5 |   address = {Boca Raton, Florida},
 6 |   year = {2015},
 7 |   edition = {2nd},
 8 |   note = {ISBN 978-1498716963},
 9 |   url = {http://yihui.name/knitr/},
10 | }
11 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/bookdown.tex:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | \documentclass[]{ctexbook}
  2 | \usepackage{lmodern}
  3 | \usepackage{amssymb,amsmath}
  4 | \usepackage{ifxetex,ifluatex}
  5 | \usepackage{fixltx2e} % provides \textsubscript
  6 | \ifnum 0\ifxetex 1\fi\ifluatex 1\fi=0 % if pdftex
  7 |   \usepackage[T1]{fontenc}
  8 |   \usepackage[utf8]{inputenc}
  9 | \else % if luatex or xelatex
 10 |   \ifxetex
 11 |     \usepackage{xltxtra,xunicode}
 12 |   \else
 13 |     \usepackage{fontspec}
 14 |   \fi
 15 |   \defaultfontfeatures{Ligatures=TeX,Scale=MatchLowercase}
 16 | \fi
 17 | % use upquote if available, for straight quotes in verbatim environments
 18 | \IfFileExists{upquote.sty}{\usepackage{upquote}}{}
 19 | % use microtype if available
 20 | \IfFileExists{microtype.sty}{%
 21 | \usepackage{microtype}
 22 | \UseMicrotypeSet[protrusion]{basicmath} % disable protrusion for tt fonts
 23 | }{}
 24 | \usepackage[b5paper,tmargin=2.5cm,bmargin=2.5cm,lmargin=3.5cm,rmargin=2.5cm]{geometry}
 25 | \usepackage[unicode=true]{hyperref}
 26 | \PassOptionsToPackage{usenames,dvipsnames}{color} % color is loaded by hyperref
 27 | \hypersetup{
 28 |             pdftitle={麻麻说我们可以用 R Markdown 写书了},
 29 |             pdfauthor={张三},
 30 |             colorlinks=true,
 31 |             linkcolor=Maroon,
 32 |             citecolor=Blue,
 33 |             urlcolor=Blue,
 34 |             breaklinks=true}
 35 | \urlstyle{same}  % don't use monospace font for urls
 36 | \usepackage{natbib}
 37 | \bibliographystyle{apalike}
 38 | \usepackage{color}
 39 | \usepackage{fancyvrb}
 40 | \newcommand{\VerbBar}{|}
 41 | \newcommand{\VERB}{\Verb[commandchars=\\\{\}]}
 42 | \DefineVerbatimEnvironment{Highlighting}{Verbatim}{commandchars=\\\{\}}
 43 | % Add ',fontsize=\small' for more characters per line
 44 | \usepackage{framed}
 45 | \definecolor{shadecolor}{RGB}{248,248,248}
 46 | \newenvironment{Shaded}{\begin{snugshade}}{\end{snugshade}}
 47 | \newcommand{\KeywordTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.13,0.29,0.53}{\textbf{#1}}}
 48 | \newcommand{\DataTypeTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.13,0.29,0.53}{#1}}
 49 | \newcommand{\DecValTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.00,0.00,0.81}{#1}}
 50 | \newcommand{\BaseNTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.00,0.00,0.81}{#1}}
 51 | \newcommand{\FloatTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.00,0.00,0.81}{#1}}
 52 | \newcommand{\ConstantTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.00,0.00,0.00}{#1}}
 53 | \newcommand{\CharTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.31,0.60,0.02}{#1}}
 54 | \newcommand{\SpecialCharTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.00,0.00,0.00}{#1}}
 55 | \newcommand{\StringTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.31,0.60,0.02}{#1}}
 56 | \newcommand{\VerbatimStringTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.31,0.60,0.02}{#1}}
 57 | \newcommand{\SpecialStringTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.31,0.60,0.02}{#1}}
 58 | \newcommand{\ImportTok}[1]{#1}
 59 | \newcommand{\CommentTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{\textit{#1}}}
 60 | \newcommand{\DocumentationTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{\textbf{\textit{#1}}}}
 61 | \newcommand{\AnnotationTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{\textbf{\textit{#1}}}}
 62 | \newcommand{\CommentVarTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{\textbf{\textit{#1}}}}
 63 | \newcommand{\OtherTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{#1}}
 64 | \newcommand{\FunctionTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.00,0.00,0.00}{#1}}
 65 | \newcommand{\VariableTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.00,0.00,0.00}{#1}}
 66 | \newcommand{\ControlFlowTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.13,0.29,0.53}{\textbf{#1}}}
 67 | \newcommand{\OperatorTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.81,0.36,0.00}{\textbf{#1}}}
 68 | \newcommand{\BuiltInTok}[1]{#1}
 69 | \newcommand{\ExtensionTok}[1]{#1}
 70 | \newcommand{\PreprocessorTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{\textit{#1}}}
 71 | \newcommand{\AttributeTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.77,0.63,0.00}{#1}}
 72 | \newcommand{\RegionMarkerTok}[1]{#1}
 73 | \newcommand{\InformationTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{\textbf{\textit{#1}}}}
 74 | \newcommand{\WarningTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.56,0.35,0.01}{\textbf{\textit{#1}}}}
 75 | \newcommand{\AlertTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.94,0.16,0.16}{#1}}
 76 | \newcommand{\ErrorTok}[1]{\textcolor[rgb]{0.64,0.00,0.00}{\textbf{#1}}}
 77 | \newcommand{\NormalTok}[1]{#1}
 78 | \usepackage{longtable,booktabs}
 79 | % Fix footnotes in tables (requires footnote package)
 80 | \IfFileExists{footnote.sty}{\usepackage{footnote}\makesavenoteenv{long table}}{}
 81 | \IfFileExists{parskip.sty}{%
 82 | \usepackage{parskip}
 83 | }{% else
 84 | \setlength{\parindent}{0pt}
 85 | \setlength{\parskip}{6pt plus 2pt minus 1pt}
 86 | }
 87 | \setlength{\emergencystretch}{3em}  % prevent overfull lines
 88 | \providecommand{\tightlist}{%
 89 |   \setlength{\itemsep}{0pt}\setlength{\parskip}{0pt}}
 90 | \setcounter{secnumdepth}{5}
 91 | % Redefines (sub)paragraphs to behave more like sections
 92 | \ifx\paragraph\undefined\else
 93 | \let\oldparagraph\paragraph
 94 | \renewcommand{\paragraph}[1]{\oldparagraph{#1}\mbox{}}
 95 | \fi
 96 | \ifx\subparagraph\undefined\else
 97 | \let\oldsubparagraph\subparagraph
 98 | \renewcommand{\subparagraph}[1]{\oldsubparagraph{#1}\mbox{}}
 99 | \fi
100 | 
101 | % set default figure placement to htbp
102 | \makeatletter
103 | \def\fps@figure{htbp}
104 | \makeatother
105 | 
106 | \usepackage{booktabs}
107 | \usepackage{longtable}
108 | 
109 | \usepackage{framed,color}
110 | \definecolor{shadecolor}{RGB}{248,248,248}
111 | 
112 | \renewcommand{\textfraction}{0.05}
113 | \renewcommand{\topfraction}{0.8}
114 | \renewcommand{\bottomfraction}{0.8}
115 | \renewcommand{\floatpagefraction}{0.75}
116 | 
117 | \let\oldhref\href
118 | \renewcommand{\href}[2]{#2\footnote{\url{#1}}}
119 | 
120 | \ifxetex
121 |   \usepackage{letltxmacro}
122 |   \setlength{\XeTeXLinkMargin}{1pt}
123 |   \LetLtxMacro\SavedIncludeGraphics\includegraphics
124 |   \def\includegraphics#1#{% #1 catches optional stuff (star/opt. arg.)
125 |     \IncludeGraphicsAux{#1}%
126 |   }%
127 |   \newcommand*{\IncludeGraphicsAux}[2]{%
128 |     \XeTeXLinkBox{%
129 |       \SavedIncludeGraphics#1{#2}%
130 |     }%
131 |   }%
132 | \fi
133 | 
134 | \makeatletter
135 | \newenvironment{kframe}{%
136 | \medskip{}
137 | \setlength{\fboxsep}{.8em}
138 |  \def\at@end@of@kframe{}%
139 |  \ifinner\ifhmode%
140 |   \def\at@end@of@kframe{\end{minipage}}%
141 |   \begin{minipage}{\columnwidth}%
142 |  \fi\fi%
143 |  \def\FrameCommand##1{\hskip\@totalleftmargin \hskip-\fboxsep
144 |  \colorbox{shadecolor}{##1}\hskip-\fboxsep
145 |      % There is no \\@totalrightmargin, so:
146 |      \hskip-\linewidth \hskip-\@totalleftmargin \hskip\columnwidth}%
147 |  \MakeFramed {\advance\hsize-\width
148 |    \@totalleftmargin\z@ \linewidth\hsize
149 |    \@setminipage}}%
150 |  {\par\unskip\endMakeFramed%
151 |  \at@end@of@kframe}
152 | \makeatother
153 | 
154 | \makeatletter
155 | \@ifundefined{Shaded}{
156 | }{\renewenvironment{Shaded}{\begin{kframe}}{\end{kframe}}}
157 | \makeatother
158 | 
159 | \usepackage{makeidx}
160 | \makeindex
161 | 
162 | \urlstyle{tt}
163 | 
164 | \usepackage{amsthm}
165 | \makeatletter
166 | \def\thm@space@setup{%
167 |   \thm@preskip=8pt plus 2pt minus 4pt
168 |   \thm@postskip=\thm@preskip
169 | }
170 | \makeatother
171 | 
172 | \frontmatter
173 | 
174 | \title{麻麻说我们可以用 R Markdown 写书了}
175 | \author{张三}
176 | \date{2017-07-07}
177 | 
178 | \let\BeginKnitrBlock\begin \let\EndKnitrBlock\end
179 | \begin{document}
180 | \maketitle
181 | 
182 | 
183 | \thispagestyle{empty}
184 | 
185 | \begin{center}
186 | 献给……
187 | 
188 | 呃，爱谁谁吧
189 | \end{center}
190 | 
191 | \setlength{\abovedisplayskip}{-5pt}
192 | \setlength{\abovedisplayshortskip}{-5pt}
193 | 
194 | {
195 | \setcounter{tocdepth}{2}
196 | \tableofcontents
197 | }
198 | \listoftables
199 | \listoffigures
200 | \chapter*{前言}
201 | 
202 | 
203 | 你好，世界。我写了一本书。这本书是这样的，第 \ref{intro}
204 | 章介绍了啥啥，第 \ref{wind} 章说了啥啥，然后是啥啥\ldots{}\ldots{}
205 | 
206 | 我用了两个 R 包编译这本书，分别是 \textbf{knitr}\index{knitr}
207 | \citep{xie2015} 和 \textbf{bookdown}\index{bookdown}
208 | \citep{R-bookdown}。以下是我的 R 进程信息：
209 | 
210 | \begin{Shaded}
211 | \begin{Highlighting}[]
212 | \KeywordTok{sessionInfo}\NormalTok{()}
213 | \end{Highlighting}
214 | \end{Shaded}
215 | 
216 | \begin{verbatim}
217 | ## R version 3.3.3 (2017-03-06)
218 | ## Platform: x86_64-apple-darwin13.4.0 (64-bit)
219 | ## Running under: macOS Sierra 10.12.4
220 | ## 
221 | ## locale:
222 | ## [1] C
223 | ## 
224 | ## attached base packages:
225 | ## [1] stats     graphics  grDevices utils     datasets 
226 | ## [6] methods   base     
227 | ## 
228 | ## loaded via a namespace (and not attached):
229 | ##  [1] backports_1.0.5 bookdown_0.4    magrittr_1.5   
230 | ##  [4] rprojroot_1.2   tools_3.3.3     htmltools_0.3.5
231 | ##  [7] rstudioapi_0.6  yaml_2.1.14     Rcpp_0.12.11   
232 | ## [10] stringi_1.1.3   rmarkdown_1.4   knitr_1.16     
233 | ## [13] stringr_1.2.0   digest_0.6.12   evaluate_0.10
234 | \end{verbatim}
235 | 
236 | \section*{致谢}
237 | 
238 | 
239 | 非常感谢谁谁以及谁谁对我的帮助。艾玛，要不是他们神一样的队友，我两年前就写完这本书了。
240 | 
241 | \BeginKnitrBlock{flushright}
242 | 张三\\
243 | 于 A 村某角落
244 | \EndKnitrBlock{flushright}
245 | 
246 | \chapter*{作者简介}\label{author}
247 | 
248 | 
249 | 上不了厅堂，下得了厨房。敲得了代码，逮得住蟑螂。
250 | 
251 | \mainmatter
252 | 
253 | \chapter{牛刀小试}\label{intro}
254 | 
255 | 现在我们可以试试 \textbf{bookdown} 的一些初级功能了，例如图表。图
256 | \ref{fig:hello} 是一幅无趣的散点图，表 \ref{tab:iris} 是一份枯燥的数据。
257 | 
258 | \begin{Shaded}
259 | \begin{Highlighting}[]
260 | \KeywordTok{par}\NormalTok{(}\DataTypeTok{mar =} \KeywordTok{c}\NormalTok{(}\DecValTok{4}\NormalTok{, }\DecValTok{4}\NormalTok{, }\DecValTok{1}\NormalTok{, .}\DecValTok{1}\NormalTok{))}
261 | \KeywordTok{plot}\NormalTok{(cars, }\DataTypeTok{pch =} \DecValTok{19}\NormalTok{)}
262 | \end{Highlighting}
263 | \end{Shaded}
264 | 
265 | \begin{figure}
266 | \includegraphics[width=0.9\linewidth]{bookdown_files/figure-latex/hello-1} \caption{<U+96F7><U+7334><U+554A><U+FF0C><U+6563><U+70B9><U+56FE><U+FF01>}\label{fig:hello}
267 | \end{figure}
268 | 
269 | \begin{Shaded}
270 | \begin{Highlighting}[]
271 | \NormalTok{knitr}\OperatorTok{::}\KeywordTok{kable}\NormalTok{(}
272 |   \KeywordTok{head}\NormalTok{(iris), }\DataTypeTok{caption =} \StringTok{'雷猴啊，iris 数据！'}\NormalTok{,}
273 |   \DataTypeTok{booktabs =} \OtherTok{TRUE}
274 | \NormalTok{)}
275 | \end{Highlighting}
276 | \end{Shaded}
277 | 
278 | \begin{table}
279 | 
280 | \caption{\label{tab:iris}<U+96F7><U+7334><U+554A><U+FF0C>iris <U+6570><U+636E><U+FF01>}
281 | \centering
282 | \begin{tabular}[t]{rrrrl}
283 | \toprule
284 | Sepal.Length & Sepal.Width & Petal.Length & Petal.Width & Species\\
285 | \midrule
286 | 5.1 & 3.5 & 1.4 & 0.2 & setosa\\
287 | 4.9 & 3.0 & 1.4 & 0.2 & setosa\\
288 | 4.7 & 3.2 & 1.3 & 0.2 & setosa\\
289 | 4.6 & 3.1 & 1.5 & 0.2 & setosa\\
290 | 5.0 & 3.6 & 1.4 & 0.2 & setosa\\
291 | 5.4 & 3.9 & 1.7 & 0.4 & setosa\\
292 | \bottomrule
293 | \end{tabular}
294 | \end{table}
295 | 
296 | 就这样，你可以一直编下去，直到编不下去。
297 | 
298 | \chapter{白苹风末}\label{wind}
299 | 
300 | 瞎扯几句。
301 | 
302 | \section{张老爷子}
303 | 
304 | 话说张老爷子写了一首诗：
305 | 
306 | \begin{quote}
307 | 姑苏开遍碧桃时，邂逅河阳女画师。\\
308 | 红豆江南留梦影，白苹风末唱秋词。
309 | \end{quote}
310 | 
311 | \section{彭大将领}
312 | 
313 | 貌似大家都喜欢用白萍风这个意境。又如彭玉麟的对联：
314 | 
315 | \begin{quote}
316 | 凭栏看云影波光，最好是红蓼花疏、白苹秋老；\\
317 | 把酒对琼楼玉宇，莫孤负天心月到、水面风来。
318 | \end{quote}
319 | 
320 | 嘿，玛尼玛尼哄。
321 | 
322 | \cleardoublepage 
323 | 
324 | \appendix \addcontentsline{toc}{chapter}{\appendixname}
325 | 
326 | 
327 | \chapter{余音绕梁}\label{sound}
328 | 
329 | 呐，到这里朕的书差不多写完了，但还有几句话要交待，所以开个附录，再啰嗦几句，各位客官稍安勿躁、扶稳坐好。
330 | 
331 | \bibliography{packages.bib,book.bib}
332 | 
333 | \backmatter
334 | \printindex
335 | 
336 | \end{document}
337 | 


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 3 | >r2
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 6 | TGAAGCGACGCTGAAAAAGCCGAAACAGTCCAGCGTGAAGGTGTCTGCGGGCGATCGTCANGAAGACAGTGCTCATGCTGCCCTGCTGACGCTTCAGGCAGAACTCCGGACGCTGGAGAAGCATGCCGGAGCAANTGAGAAAATCAGCCAGCAGCGCCGGGATTTGTGGAAGGCGGAGAGTCTGTTCGCGGTACTGGAGGNGGCGGCGCAACGTCGCCAGCTGTGTGCACAGGAGAAATCCCTGCTGGCGCATAAAGATGAGACGCTGGAGTACAAACGCCAGCTGGCTGCACTTGGCGACAAGGTTACGTATCAGGAGCGCCTGAACGCGCTGGCGCAGCAGGCGGATAAATTCGCACAGCAGCAACGGGCAAAACGGGCCGCCATTGATGCGAAAAGCCGGGGGCTGACTGACCGGCAGGCAGAACGGGAAGCCACGGAACANCGCCTGAAGGAACAGTATGGCGATAATCCGCTGGCGCTGAATAACGTCATGTNAGAGCAGAAAAAGACCTGGGCGGCTGAAGACCAGCTTCGCGGGAACTGGATGGCAGGCCTGAAGTCCGNCTGNAGTGAGTGGGAAGAGAGCGCCACGGACTGTATGTCGCAGGTAAAAAGTGCAGCCACGCAGACCTTTGATGGTATTGCACAGAATATGGCGGCGATGCTGACCGACAGTGAGCAGAACTGGCGCAGCTTCACCCGTTCCGTGCTGTCCATGATGACAGAAATTCTGCTTAANCAGGCAATCGTGGGGATTGTCGGGAGTATCGGCAGCGCCATTGGCGGGGCTGTTGGTGG
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 9 | >r5
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11 | 


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 3 | +
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 5 | @r2
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 9 | @r3
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11 | +
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13 | @r4
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15 | +
16 | F(32>77B22+D/$%<D<BF)<<+HH#CB9+&28:!4C.)83"&5'36::G;4=9CCF.*1.8B
17 | @r5
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21 | 


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44 | 


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--------------------------------------------------------------------------------
 1 | --- 
 2 | title: "生物信息学最佳实践--基础篇"
 3 | author: "曾健明"
 4 | date: "`r Sys.Date()`"
 5 | documentclass: ctexbook
 6 | bibliography: [book.bib, packages.bib]
 7 | biblio-style: apalike
 8 | link-citations: yes
 9 | colorlinks: yes
10 | lot: yes
11 | lof: yes
12 | geometry: [b5paper, tmargin=2.5cm, bmargin=2.5cm, lmargin=3.5cm, rmargin=2.5cm]
13 | site: bookdown::bookdown_site
14 | description: "对应着生信技能树论坛的6个基础板块，包括数据产出，数据规范，数据库资源，统计学，计算机以及生物学基础"
15 | github-repo: best-practices-in-bioinformatics/basic
16 | cover-image: cover.png
17 | ---
18 | 
19 | ```{r setup, include=FALSE}
20 | options(
21 |   htmltools.dir.version = FALSE, formatR.indent = 2, width = 55, digits = 4
22 | )
23 | 
24 | # 填上你需要用到的包，如 c('ggplot2', 'dplyr')
25 | lapply(c('Rsamtools'), function(pkg) {
26 |   if (system.file(package = pkg) == '') install.packages(pkg)
27 | })
28 | ```
29 | 
30 | # 前言 {-} 
31 | 
32 | 生物信息学的重头戏就是处理各种各样的数据，**第 \@ref(sequencing) 章**介绍了生物信息学主流数据产生方法，包括多种多样的芯片技术，二代测序技术和三代测序技术。
33 | 
34 | 既然数据的来源是如此的丰富多样，而且指定标准的单位比较多，就必然会产生各种各样的数据存储形式来规范化交流，**第 \@ref(filetype) 章**会详细介绍fastq,fasta,sam,bam,vcf,gff,gtf,bed,MAF等，理解了它们才能真正的入门生物信息学。
35 | 
36 | 了解了生物信息学领域的常见数据的产生和数据规范还不够，非常高频的需求是跟已有的各种数据库资源做比较，包括与参考基因组比对，基因结构以及功能的注释等等。**第\@ref(database) 章**会详细介绍生信工作者必须了解的主流数据库，包括NCBI,UCSC,ENSEMBL，以及GO,KEGG,GENCODE,SRTINGDB,还有TCGA,ENCODE,1000GENOMES等等。
37 | 
38 | 做生物信息学数据分析的大多统计学不是太好，而且我们这本书却是基础教程，整个架构就类似于一个网站首页的导航条，所以我们不会太深入讲解统计学原理以及公式。在**第\@ref(statistics) 章**会罗列一些统计学常识以及高频统计学分析方法。当然，也会推荐一些好的学习资源供大家深入学习提高自己。
39 | 
40 | 至于计算机方面，我一直给大家强调一个**去可视化**的精神，虽然表面上看是反人类的操作习惯，但是在数据分析领域非常实用。因为大量的生物信息学软件并没有对桌面操作系统兼容，同时**批量操作**也是常态，这个时候就无法用鼠标傻瓜式的不停点击了。
41 | 如果是Windows电脑，那么必须安装,git,notepad++,everything,xshell,winscp这些软件，然后想方设法找到linux服务器连接到终端就可以处理数据啦。如果是MAC的话，直接打开终端即可。要数量在终端操作各种数据就必须学好shell命令。如果是常规的流程化分析，那么shell脚本就足够了。但真正的数据分析过程中经常会遇到个性化的需求，可以选择perl或者python来完成。同时R语言也是必修，因为它涵盖了统计分析，可视化，以及生物信息学bioconductor包。这些全部**第\@ref(computering) 章**会介绍。
42 | 
43 | 最后是生物学基础，在**第\@ref(biology) 章**介绍。因为大部分看这本书的朋友都是生物学背景，所以把这个放在最后。其实主要也是介绍概念，生物学概念太磅礴了，这里只是介绍那些在生物信息学数据处理实战中经常用得着的那些知识点。首当其冲的就是中心法则啦，以及它包含的DNA,RNA,PROTEIN，为了量化这一个法则而扩展出了各种测序组学分析领域。
44 | 
45 | 我用了两个 R 包编译这本书，分别是 **knitr**\index{knitr} [@xie2015] 和 **bookdown**\index{bookdown} [@R-bookdown]。以下是我的 R 进程信息：
46 | 
47 | ```{r}
48 | sessionInfo()
49 | ```
50 | 
51 | ## 致谢 {-}
52 | 
53 | 非常感谢[生信菜鸟团](http://www.bio-info-trainee.com/)以及[生信技能树](http://www.biotrainee.com/)对我的帮助。艾玛，要不是他们神一样的队友，我两年前就写完这本书了。
54 | 
55 | 
56 | ```{block2, type='flushright', html.tag='p'}
57 | 曾健明 
58 | 于 珠海横琴某渔村
59 | ```
60 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/latex/after_body.tex:
--------------------------------------------------------------------------------
1 | \backmatter
2 | \printindex
3 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/latex/before_body.tex:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | 
 2 | \thispagestyle{empty}
 3 | 
 4 | \begin{center}
 5 | 献给……
 6 | 
 7 | 呃，爱谁谁吧
 8 | \end{center}
 9 | 
10 | \setlength{\abovedisplayskip}{-5pt}
11 | \setlength{\abovedisplayshortskip}{-5pt}
12 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/latex/preamble.tex:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | \usepackage{booktabs}
 2 | \usepackage{longtable}
 3 | 
 4 | \usepackage{framed,color}
 5 | \definecolor{shadecolor}{RGB}{248,248,248}
 6 | 
 7 | \renewcommand{\textfraction}{0.05}
 8 | \renewcommand{\topfraction}{0.8}
 9 | \renewcommand{\bottomfraction}{0.8}
10 | \renewcommand{\floatpagefraction}{0.75}
11 | 
12 | \let\oldhref\href
13 | \renewcommand{\href}[2]{#2\footnote{\url{#1}}}
14 | 
15 | \ifxetex
16 |   \usepackage{letltxmacro}
17 |   \setlength{\XeTeXLinkMargin}{1pt}
18 |   \LetLtxMacro\SavedIncludeGraphics\includegraphics
19 |   \def\includegraphics#1#{% #1 catches optional stuff (star/opt. arg.)
20 |     \IncludeGraphicsAux{#1}%
21 |   }%
22 |   \newcommand*{\IncludeGraphicsAux}[2]{%
23 |     \XeTeXLinkBox{%
24 |       \SavedIncludeGraphics#1{#2}%
25 |     }%
26 |   }%
27 | \fi
28 | 
29 | \makeatletter
30 | \newenvironment{kframe}{%
31 | \medskip{}
32 | \setlength{\fboxsep}{.8em}
33 |  \def\at@end@of@kframe{}%
34 |  \ifinner\ifhmode%
35 |   \def\at@end@of@kframe{\end{minipage}}%
36 |   \begin{minipage}{\columnwidth}%
37 |  \fi\fi%
38 |  \def\FrameCommand##1{\hskip\@totalleftmargin \hskip-\fboxsep
39 |  \colorbox{shadecolor}{##1}\hskip-\fboxsep
40 |      % There is no \\@totalrightmargin, so:
41 |      \hskip-\linewidth \hskip-\@totalleftmargin \hskip\columnwidth}%
42 |  \MakeFramed {\advance\hsize-\width
43 |    \@totalleftmargin\z@ \linewidth\hsize
44 |    \@setminipage}}%
45 |  {\par\unskip\endMakeFramed%
46 |  \at@end@of@kframe}
47 | \makeatother
48 | 
49 | \makeatletter
50 | \@ifundefined{Shaded}{
51 | }{\renewenvironment{Shaded}{\begin{kframe}}{\end{kframe}}}
52 | \makeatother
53 | 
54 | \usepackage{makeidx}
55 | \makeindex
56 | 
57 | \urlstyle{tt}
58 | 
59 | \usepackage{amsthm}
60 | \makeatletter
61 | \def\thm@space@setup{%
62 |   \thm@preskip=8pt plus 2pt minus 4pt
63 |   \thm@postskip=\thm@preskip
64 | }
65 | \makeatother
66 | 
67 | \frontmatter
68 | 


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https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/libs/gitbook-2.6.7/css/fontawesome/fontawesome-webfont.ttf


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  1 | .book .book-header h1 {
  2 |   padding-left: 20px;
  3 |   padding-right: 20px;
  4 | }
  5 | .book .book-header.fixed {
  6 |   position: fixed;
  7 |   right: 0;
  8 |   top: 0;
  9 |   left: 0;
 10 |   border-bottom: 1px solid rgba(0,0,0,.07);
 11 | }
 12 | span.search-highlight {
 13 |   background-color: #ffff88;
 14 | }
 15 | @media (min-width: 600px) {
 16 |   .book.with-summary .book-header.fixed {
 17 |     left: 300px;
 18 |   }
 19 | }
 20 | @media (max-width: 1240px) {
 21 |   .book .book-body.fixed {
 22 |     top: 50px;
 23 |   }
 24 |   .book .book-body.fixed .body-inner {
 25 |     top: auto;
 26 |   }
 27 | }
 28 | @media (max-width: 600px) {
 29 |   .book.with-summary .book-header.fixed {
 30 |     left: calc(100% - 60px);
 31 |     min-width: 300px;
 32 |   }
 33 |   .book.with-summary .book-body {
 34 |     transform: none;
 35 |     left: calc(100% - 60px);
 36 |     min-width: 300px;
 37 |   }
 38 |   .book .book-body.fixed {
 39 |     top: 0;
 40 |   }
 41 | }
 42 | 
 43 | .book .book-body.fixed .body-inner {
 44 |   top: 50px;
 45 | }
 46 | .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal sub, .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal sup {
 47 |   font-size: 85%;
 48 | }
 49 | 
 50 | @media print {
 51 |   .book .book-summary, .book .book-body .book-header, .fa {
 52 |     display: none !important;
 53 |   }
 54 |   .book .book-body.fixed {
 55 |     left: 0px;
 56 |   }
 57 |   .book .book-body,.book .book-body .body-inner, .book.with-summary {
 58 |     overflow: visible !important;
 59 |   }
 60 | }
 61 | .kable_wrapper {
 62 |   border-spacing: 20px 0;
 63 |   border-collapse: separate;
 64 |   border: none;
 65 |   margin: auto;
 66 | }
 67 | .kable_wrapper > tbody > tr > td {
 68 |   vertical-align: top;
 69 | }
 70 | .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table tr.header {
 71 |   border-top-width: 2px;
 72 | }
 73 | .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table tr:last-child td {
 74 |   border-bottom-width: 2px;
 75 | }
 76 | .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table td, .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table th {
 77 |   border-left: none;
 78 |   border-right: none;
 79 | }
 80 | .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table.kable_wrapper > tbody > tr, .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table.kable_wrapper > tbody > tr > td {
 81 |   border-top: none;
 82 | }
 83 | .book .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table.kable_wrapper > tbody > tr:last-child > td {
 84 |     border-bottom: none;
 85 | }
 86 | 
 87 | div.theorem, div.lemma, div.corollary, div.proposition {
 88 |   font-style: italic;
 89 | }
 90 | span.theorem, span.lemma, span.corollary, span.proposition {
 91 |   font-style: normal;
 92 | }
 93 | div.proof:after {
 94 |   content: "\25a2";
 95 |   float: right;
 96 | }
 97 | .header-section-number {
 98 |   padding-right: .5em;
 99 | }
100 | 


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  1 | /*
  2 |  * Theme 1
  3 |  */
  4 | .color-theme-1 .dropdown-menu {
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  6 |   border-color: #7e888b;
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  9 |   border-bottom: 9px solid #111111;
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 12 |   border-color: #7e888b;
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 15 |   color: #afa790;
 16 | }
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 18 |   color: #73553c;
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 20 | /*
 21 |  * Theme 2
 22 |  */
 23 | .color-theme-2 .dropdown-menu {
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 27 | .color-theme-2 .dropdown-menu .dropdown-caret .caret-inner {
 28 |   border-bottom: 9px solid #2d3143;
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 37 |   color: #f4f4f5;
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 39 | .book .book-header .font-settings .font-enlarge {
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 43 | .book .book-header .font-settings .font-reduce {
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 45 |   font-size: 1em;
 46 | }
 47 | .book.color-theme-1 .book-body {
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 50 | }
 51 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section {
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 53 | }
 54 | .book.color-theme-2 .book-body {
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 56 |   background: #1c1f2b;
 57 | }
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 66 | }
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 80 |   font-family: "Helvetica Neue", Helvetica, Arial, sans-serif;
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 89 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal h2,
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 94 |   color: inherit;
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 99 | }
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101 |   color: inherit;
102 | }
103 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal hr {
104 |   background-color: inherit;
105 | }
106 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal blockquote {
107 |   border-color: inherit;
108 | }
109 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal pre,
110 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal code {
111 |   background: #fdf6e3;
112 |   color: #657b83;
113 |   border-color: #f8df9c;
114 | }
115 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal .highlight {
116 |   background-color: inherit;
117 | }
118 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table th,
119 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table td {
120 |   border-color: #f5d06c;
121 | }
122 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table tr {
123 |   color: inherit;
124 |   background-color: #fdf6e3;
125 |   border-color: #444444;
126 | }
127 | .book.color-theme-1 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table tr:nth-child(2n) {
128 |   background-color: #fbeecb;
129 | }
130 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal {
131 |   color: #bdcadb;
132 | }
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134 |   color: #3eb1d0;
135 | }
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149 |   color: #373b4e;
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151 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal hr {
152 |   background-color: #373b4e;
153 | }
154 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal blockquote {
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156 | }
157 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal pre,
158 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal code {
159 |   color: #9dbed8;
160 |   background: #2d3143;
161 |   border-color: #2d3143;
162 | }
163 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal .highlight {
164 |   background-color: #282a39;
165 | }
166 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table th,
167 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table td {
168 |   border-color: #3b3f54;
169 | }
170 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table tr {
171 |   color: #b6c2d2;
172 |   background-color: #2d3143;
173 |   border-color: #3b3f54;
174 | }
175 | .book.color-theme-2 .book-body .page-wrapper .page-inner section.normal table tr:nth-child(2n) {
176 |   background-color: #35394b;
177 | }
178 | .book.color-theme-1 .book-header {
179 |   color: #afa790;
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213 |   color: #383f52;
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216 |   color: #fffff5;
217 | }
218 | /*
219 |  * Theme 1
220 |  */
221 | .book.color-theme-1 .book-summary {
222 |   color: #afa790;
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225 | }
226 | .book.color-theme-1 .book-summary .book-search {
227 |   background: transparent;
228 | }
229 | .book.color-theme-1 .book-summary .book-search input,
230 | .book.color-theme-1 .book-summary .book-search input:focus {
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232 | }
233 | .book.color-theme-1 .book-summary ul.summary li.divider {
234 |   background: #7e888b;
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237 | .book.color-theme-1 .book-summary ul.summary li i.fa-check {
238 |   color: #33cc33;
239 | }
240 | .book.color-theme-1 .book-summary ul.summary li.done > a {
241 |   color: #877f6a;
242 | }
243 | .book.color-theme-1 .book-summary ul.summary li a,
244 | .book.color-theme-1 .book-summary ul.summary li span {
245 |   color: #877f6a;
246 |   background: transparent;
247 |   font-weight: normal;
248 | }
249 | .book.color-theme-1 .book-summary ul.summary li.active > a,
250 | .book.color-theme-1 .book-summary ul.summary li a:hover {
251 |   color: #704214;
252 |   background: transparent;
253 |   font-weight: normal;
254 | }
255 | /*
256 |  * Theme 2
257 |  */
258 | .book.color-theme-2 .book-summary {
259 |   color: #bcc1d2;
260 |   background: #2d3143;
261 |   border-right: none;
262 | }
263 | .book.color-theme-2 .book-summary .book-search {
264 |   background: transparent;
265 | }
266 | .book.color-theme-2 .book-summary .book-search input,
267 | .book.color-theme-2 .book-summary .book-search input:focus {
268 |   border: 1px solid transparent;
269 | }
270 | .book.color-theme-2 .book-summary ul.summary li.divider {
271 |   background: #272a3a;
272 |   box-shadow: none;
273 | }
274 | .book.color-theme-2 .book-summary ul.summary li i.fa-check {
275 |   color: #33cc33;
276 | }
277 | .book.color-theme-2 .book-summary ul.summary li.done > a {
278 |   color: #62687f;
279 | }
280 | .book.color-theme-2 .book-summary ul.summary li a,
281 | .book.color-theme-2 .book-summary ul.summary li span {
282 |   color: #c1c6d7;
283 |   background: transparent;
284 |   font-weight: 600;
285 | }
286 | .book.color-theme-2 .book-summary ul.summary li.active > a,
287 | .book.color-theme-2 .book-summary ul.summary li a:hover {
288 |   color: #f4f4f5;
289 |   background: #252737;
290 |   font-weight: 600;
291 | }
292 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/libs/gitbook-2.6.7/css/plugin-search.css:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | .book .book-summary .book-search {
 2 |   padding: 6px;
 3 |   background: transparent;
 4 |   position: absolute;
 5 |   top: -50px;
 6 |   left: 0px;
 7 |   right: 0px;
 8 |   transition: top 0.5s ease;
 9 | }
10 | .book .book-summary .book-search input,
11 | .book .book-summary .book-search input:focus,
12 | .book .book-summary .book-search input:hover {
13 |   width: 100%;
14 |   background: transparent;
15 |   border: 1px solid #ccc;
16 |   box-shadow: none;
17 |   outline: none;
18 |   line-height: 22px;
19 |   padding: 7px 4px;
20 |   color: inherit;
21 |   box-sizing: border-box;
22 | }
23 | .book.with-search .book-summary .book-search {
24 |   top: 0px;
25 | }
26 | .book.with-search .book-summary ul.summary {
27 |   top: 50px;
28 | }
29 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/libs/gitbook-2.6.7/js/jquery.highlight.js:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | gitbook.require(["jQuery"], function(jQuery) {
 2 | 
 3 | /*
 4 |  * jQuery Highlight plugin
 5 |  *
 6 |  * Based on highlight v3 by Johann Burkard
 7 |  * http://johannburkard.de/blog/programming/javascript/highlight-javascript-text-higlighting-jquery-plugin.html
 8 |  *
 9 |  * Code a little bit refactored and cleaned (in my humble opinion).
10 |  * Most important changes:
11 |  *  - has an option to highlight only entire words (wordsOnly - false by default),
12 |  *  - has an option to be case sensitive (caseSensitive - false by default)
13 |  *  - highlight element tag and class names can be specified in options
14 |  *
15 |  * Copyright (c) 2009 Bartek Szopka
16 |  *
17 |  * Licensed under MIT license.
18 |  *
19 |  */
20 | 
21 | jQuery.extend({
22 |     highlight: function (node, re, nodeName, className) {
23 |         if (node.nodeType === 3) {
24 |             var match = node.data.match(re);
25 |             if (match) {
26 |                 var highlight = document.createElement(nodeName || 'span');
27 |                 highlight.className = className || 'highlight';
28 |                 var wordNode = node.splitText(match.index);
29 |                 wordNode.splitText(match[0].length);
30 |                 var wordClone = wordNode.cloneNode(true);
31 |                 highlight.appendChild(wordClone);
32 |                 wordNode.parentNode.replaceChild(highlight, wordNode);
33 |                 return 1; //skip added node in parent
34 |             }
35 |         } else if ((node.nodeType === 1 && node.childNodes) && // only element nodes that have children
36 |                 !/(script|style)/i.test(node.tagName) && // ignore script and style nodes
37 |                 !(node.tagName === nodeName.toUpperCase() && node.className === className)) { // skip if already highlighted
38 |             for (var i = 0; i < node.childNodes.length; i++) {
39 |                 i += jQuery.highlight(node.childNodes[i], re, nodeName, className);
40 |             }
41 |         }
42 |         return 0;
43 |     }
44 | });
45 | 
46 | jQuery.fn.unhighlight = function (options) {
47 |     var settings = { className: 'highlight', element: 'span' };
48 |     jQuery.extend(settings, options);
49 | 
50 |     return this.find(settings.element + "." + settings.className).each(function () {
51 |         var parent = this.parentNode;
52 |         parent.replaceChild(this.firstChild, this);
53 |         parent.normalize();
54 |     }).end();
55 | };
56 | 
57 | jQuery.fn.highlight = function (words, options) {
58 |     var settings = { className: 'highlight', element: 'span', caseSensitive: false, wordsOnly: false };
59 |     jQuery.extend(settings, options);
60 | 
61 |     if (words.constructor === String) {
62 |         words = [words];
63 |     }
64 |     words = jQuery.grep(words, function(word, i){
65 |       return word !== '';
66 |     });
67 |     words = jQuery.map(words, function(word, i) {
68 |       return word.replace(/[-[\]{}()*+?.,\\^$|#\s]/g, "\\$&");
69 |     });
70 |     if (words.length === 0) { return this; }
71 | 
72 |     var flag = settings.caseSensitive ? "" : "i";
73 |     var pattern = "(" + words.join("|") + ")";
74 |     if (settings.wordsOnly) {
75 |         pattern = "\\b" + pattern + "\\b";
76 |     }
77 |     var re = new RegExp(pattern, flag);
78 | 
79 |     return this.each(function () {
80 |         jQuery.highlight(this, re, settings.element, settings.className);
81 |     });
82 | };
83 | 
84 | });
85 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/libs/gitbook-2.6.7/js/lunr.js:
--------------------------------------------------------------------------------
1 | /**
2 |  * lunr - http://lunrjs.com - A bit like Solr, but much smaller and not as bright - 0.5.12
3 |  * Copyright (C) 2015 Oliver Nightingale
4 |  * MIT Licensed
5 |  * @license
6 |  */
7 | !function(){var t=function(e){var n=new t.Index;return n.pipeline.add(t.trimmer,t.stopWordFilter,t.stemmer),e&&e.call(n,n),n};t.version="0.5.12",t.utils={},t.utils.warn=function(t){return function(e){t.console&&console.warn&&console.warn(e)}}(this),t.EventEmitter=function(){this.events={}},t.EventEmitter.prototype.addListener=function(){var t=Array.prototype.slice.call(arguments),e=t.pop(),n=t;if("function"!=typeof e)throw new TypeError("last argument must be a function");n.forEach(function(t){this.hasHandler(t)||(this.events[t]=[]),this.events[t].push(e)},this)},t.EventEmitter.prototype.removeListener=function(t,e){if(this.hasHandler(t)){var n=this.events[t].indexOf(e);this.events[t].splice(n,1),this.events[t].length||delete this.events[t]}},t.EventEmitter.prototype.emit=function(t){if(this.hasHandler(t)){var e=Array.prototype.slice.call(arguments,1);this.events[t].forEach(function(t){t.apply(void 0,e)})}},t.EventEmitter.prototype.hasHandler=function(t){return t in this.events},t.tokenizer=function(t){return arguments.length&&null!=t&&void 0!=t?Array.isArray(t)?t.map(function(t){return t.toLowerCase()}):t.toString().trim().toLowerCase().split(/[\s\-\/]+/):[]},t.Pipeline=function(){this._stack=[]},t.Pipeline.registeredFunctions={},t.Pipeline.registerFunction=function(e,n){n in this.registeredFunctions&&t.utils.warn("Overwriting existing registered function: "+n),e.label=n,t.Pipeline.registeredFunctions[e.label]=e},t.Pipeline.warnIfFunctionNotRegistered=function(e){var n=e.label&&e.label in this.registeredFunctions;n||t.utils.warn("Function is not registered with pipeline. This may cause problems when serialising the index.\n",e)},t.Pipeline.load=function(e){var n=new t.Pipeline;return e.forEach(function(e){var i=t.Pipeline.registeredFunctions[e];if(!i)throw new Error("Cannot load un-registered function: "+e);n.add(i)}),n},t.Pipeline.prototype.add=function(){var e=Array.prototype.slice.call(arguments);e.forEach(function(e){t.Pipeline.warnIfFunctionNotRegistered(e),this._stack.push(e)},this)},t.Pipeline.prototype.after=function(e,n){t.Pipeline.warnIfFunctionNotRegistered(n);var i=this._stack.indexOf(e);if(-1==i)throw new Error("Cannot find existingFn");i+=1,this._stack.splice(i,0,n)},t.Pipeline.prototype.before=function(e,n){t.Pipeline.warnIfFunctionNotRegistered(n);var i=this._stack.indexOf(e);if(-1==i)throw new Error("Cannot find existingFn");this._stack.splice(i,0,n)},t.Pipeline.prototype.remove=function(t){var e=this._stack.indexOf(t);-1!=e&&this._stack.splice(e,1)},t.Pipeline.prototype.run=function(t){for(var e=[],n=t.length,i=this._stack.length,o=0;n>o;o++){for(var r=t[o],s=0;i>s&&(r=this._stack[s](r,o,t),void 0!==r);s++);void 0!==r&&e.push(r)}return e},t.Pipeline.prototype.reset=function(){this._stack=[]},t.Pipeline.prototype.toJSON=function(){return this._stack.map(function(e){return t.Pipeline.warnIfFunctionNotRegistered(e),e.label})},t.Vector=function(){this._magnitude=null,this.list=void 0,this.length=0},t.Vector.Node=function(t,e,n){this.idx=t,this.val=e,this.next=n},t.Vector.prototype.insert=function(e,n){this._magnitude=void 0;var i=this.list;if(!i)return this.list=new t.Vector.Node(e,n,i),this.length++;if(e<i.idx)return this.list=new t.Vector.Node(e,n,i),this.length++;for(var o=i,r=i.next;void 0!=r;){if(e<r.idx)return o.next=new t.Vector.Node(e,n,r),this.length++;o=r,r=r.next}return o.next=new t.Vector.Node(e,n,r),this.length++},t.Vector.prototype.magnitude=function(){if(this._magnitude)return this._magnitude;for(var t,e=this.list,n=0;e;)t=e.val,n+=t*t,e=e.next;return this._magnitude=Math.sqrt(n)},t.Vector.prototype.dot=function(t){for(var e=this.list,n=t.list,i=0;e&&n;)e.idx<n.idx?e=e.next:e.idx>n.idx?n=n.next:(i+=e.val*n.val,e=e.next,n=n.next);return i},t.Vector.prototype.similarity=function(t){return this.dot(t)/(this.magnitude()*t.magnitude())},t.SortedSet=function(){this.length=0,this.elements=[]},t.SortedSet.load=function(t){var e=new this;return e.elements=t,e.length=t.length,e},t.SortedSet.prototype.add=function(){var t,e;for(t=0;t<arguments.length;t++)e=arguments[t],~this.indexOf(e)||this.elements.splice(this.locationFor(e),0,e);this.length=this.elements.length},t.SortedSet.prototype.toArray=function(){return this.elements.slice()},t.SortedSet.prototype.map=function(t,e){return this.elements.map(t,e)},t.SortedSet.prototype.forEach=function(t,e){return this.elements.forEach(t,e)},t.SortedSet.prototype.indexOf=function(t){for(var e=0,n=this.elements.length,i=n-e,o=e+Math.floor(i/2),r=this.elements[o];i>1;){if(r===t)return o;t>r&&(e=o),r>t&&(n=o),i=n-e,o=e+Math.floor(i/2),r=this.elements[o]}return r===t?o:-1},t.SortedSet.prototype.locationFor=function(t){for(var e=0,n=this.elements.length,i=n-e,o=e+Math.floor(i/2),r=this.elements[o];i>1;)t>r&&(e=o),r>t&&(n=o),i=n-e,o=e+Math.floor(i/2),r=this.elements[o];return r>t?o:t>r?o+1:void 0},t.SortedSet.prototype.intersect=function(e){for(var n=new t.SortedSet,i=0,o=0,r=this.length,s=e.length,a=this.elements,h=e.elements;;){if(i>r-1||o>s-1)break;a[i]!==h[o]?a[i]<h[o]?i++:a[i]>h[o]&&o++:(n.add(a[i]),i++,o++)}return n},t.SortedSet.prototype.clone=function(){var e=new t.SortedSet;return e.elements=this.toArray(),e.length=e.elements.length,e},t.SortedSet.prototype.union=function(t){var e,n,i;return this.length>=t.length?(e=this,n=t):(e=t,n=this),i=e.clone(),i.add.apply(i,n.toArray()),i},t.SortedSet.prototype.toJSON=function(){return this.toArray()},t.Index=function(){this._fields=[],this._ref="id",this.pipeline=new t.Pipeline,this.documentStore=new t.Store,this.tokenStore=new t.TokenStore,this.corpusTokens=new t.SortedSet,this.eventEmitter=new t.EventEmitter,this._idfCache={},this.on("add","remove","update",function(){this._idfCache={}}.bind(this))},t.Index.prototype.on=function(){var t=Array.prototype.slice.call(arguments);return this.eventEmitter.addListener.apply(this.eventEmitter,t)},t.Index.prototype.off=function(t,e){return this.eventEmitter.removeListener(t,e)},t.Index.load=function(e){e.version!==t.version&&t.utils.warn("version mismatch: current "+t.version+" importing "+e.version);var n=new this;return n._fields=e.fields,n._ref=e.ref,n.documentStore=t.Store.load(e.documentStore),n.tokenStore=t.TokenStore.load(e.tokenStore),n.corpusTokens=t.SortedSet.load(e.corpusTokens),n.pipeline=t.Pipeline.load(e.pipeline),n},t.Index.prototype.field=function(t,e){var e=e||{},n={name:t,boost:e.boost||1};return this._fields.push(n),this},t.Index.prototype.ref=function(t){return this._ref=t,this},t.Index.prototype.add=function(e,n){var i={},o=new t.SortedSet,r=e[this._ref],n=void 0===n?!0:n;this._fields.forEach(function(n){var r=this.pipeline.run(t.tokenizer(e[n.name]));i[n.name]=r,t.SortedSet.prototype.add.apply(o,r)},this),this.documentStore.set(r,o),t.SortedSet.prototype.add.apply(this.corpusTokens,o.toArray());for(var s=0;s<o.length;s++){var a=o.elements[s],h=this._fields.reduce(function(t,e){var n=i[e.name].length;if(!n)return t;var o=i[e.name].filter(function(t){return t===a}).length;return t+o/n*e.boost},0);this.tokenStore.add(a,{ref:r,tf:h})}n&&this.eventEmitter.emit("add",e,this)},t.Index.prototype.remove=function(t,e){var n=t[this._ref],e=void 0===e?!0:e;if(this.documentStore.has(n)){var i=this.documentStore.get(n);this.documentStore.remove(n),i.forEach(function(t){this.tokenStore.remove(t,n)},this),e&&this.eventEmitter.emit("remove",t,this)}},t.Index.prototype.update=function(t,e){var e=void 0===e?!0:e;this.remove(t,!1),this.add(t,!1),e&&this.eventEmitter.emit("update",t,this)},t.Index.prototype.idf=function(t){var e="@"+t;if(Object.prototype.hasOwnProperty.call(this._idfCache,e))return this._idfCache[e];var n=this.tokenStore.count(t),i=1;return n>0&&(i=1+Math.log(this.documentStore.length/n)),this._idfCache[e]=i},t.Index.prototype.search=function(e){var n=this.pipeline.run(t.tokenizer(e)),i=new t.Vector,o=[],r=this._fields.reduce(function(t,e){return t+e.boost},0),s=n.some(function(t){return this.tokenStore.has(t)},this);if(!s)return[];n.forEach(function(e,n,s){var a=1/s.length*this._fields.length*r,h=this,l=this.tokenStore.expand(e).reduce(function(n,o){var r=h.corpusTokens.indexOf(o),s=h.idf(o),l=1,u=new t.SortedSet;if(o!==e){var c=Math.max(3,o.length-e.length);l=1/Math.log(c)}return r>-1&&i.insert(r,a*s*l),Object.keys(h.tokenStore.get(o)).forEach(function(t){u.add(t)}),n.union(u)},new t.SortedSet);o.push(l)},this);var a=o.reduce(function(t,e){return t.intersect(e)});return a.map(function(t){return{ref:t,score:i.similarity(this.documentVector(t))}},this).sort(function(t,e){return e.score-t.score})},t.Index.prototype.documentVector=function(e){for(var n=this.documentStore.get(e),i=n.length,o=new t.Vector,r=0;i>r;r++){var s=n.elements[r],a=this.tokenStore.get(s)[e].tf,h=this.idf(s);o.insert(this.corpusTokens.indexOf(s),a*h)}return o},t.Index.prototype.toJSON=function(){return{version:t.version,fields:this._fields,ref:this._ref,documentStore:this.documentStore.toJSON(),tokenStore:this.tokenStore.toJSON(),corpusTokens:this.corpusTokens.toJSON(),pipeline:this.pipeline.toJSON()}},t.Index.prototype.use=function(t){var e=Array.prototype.slice.call(arguments,1);e.unshift(this),t.apply(this,e)},t.Store=function(){this.store={},this.length=0},t.Store.load=function(e){var n=new this;return n.length=e.length,n.store=Object.keys(e.store).reduce(function(n,i){return n[i]=t.SortedSet.load(e.store[i]),n},{}),n},t.Store.prototype.set=function(t,e){this.has(t)||this.length++,this.store[t]=e},t.Store.prototype.get=function(t){return this.store[t]},t.Store.prototype.has=function(t){return t in this.store},t.Store.prototype.remove=function(t){this.has(t)&&(delete this.store[t],this.length--)},t.Store.prototype.toJSON=function(){return{store:this.store,length:this.length}},t.stemmer=function(){var t={ational:"ate",tional:"tion",enci:"ence",anci:"ance",izer:"ize",bli:"ble",alli:"al",entli:"ent",eli:"e",ousli:"ous",ization:"ize",ation:"ate",ator:"ate",alism:"al",iveness:"ive",fulness:"ful",ousness:"ous",aliti:"al",iviti:"ive",biliti:"ble",logi:"log"},e={icate:"ic",ative:"",alize:"al",iciti:"ic",ical:"ic",ful:"",ness:""},n="[^aeiou]",i="[aeiouy]",o=n+"[^aeiouy]*",r=i+"[aeiou]*",s="^("+o+")?"+r+o,a="^("+o+")?"+r+o+"("+r+")?$",h="^("+o+")?"+r+o+r+o,l="^("+o+")?"+i,u=new RegExp(s),c=new RegExp(h),f=new RegExp(a),d=new RegExp(l),p=/^(.+?)(ss|i)es$/,m=/^(.+?)([^s])s$/,v=/^(.+?)eed$/,y=/^(.+?)(ed|ing)$/,g=/.$/,S=/(at|bl|iz)$/,w=new RegExp("([^aeiouylsz])\\1$"),x=new RegExp("^"+o+i+"[^aeiouwxy]$"),k=/^(.+?[^aeiou])y$/,b=/^(.+?)(ational|tional|enci|anci|izer|bli|alli|entli|eli|ousli|ization|ation|ator|alism|iveness|fulness|ousness|aliti|iviti|biliti|logi)$/,E=/^(.+?)(icate|ative|alize|iciti|ical|ful|ness)$/,_=/^(.+?)(al|ance|ence|er|ic|able|ible|ant|ement|ment|ent|ou|ism|ate|iti|ous|ive|ize)$/,F=/^(.+?)(s|t)(ion)$/,O=/^(.+?)e$/,P=/ll$/,N=new RegExp("^"+o+i+"[^aeiouwxy]$"),T=function(n){var i,o,r,s,a,h,l;if(n.length<3)return n;if(r=n.substr(0,1),"y"==r&&(n=r.toUpperCase()+n.substr(1)),s=p,a=m,s.test(n)?n=n.replace(s,"$1$2"):a.test(n)&&(n=n.replace(a,"$1$2")),s=v,a=y,s.test(n)){var T=s.exec(n);s=u,s.test(T[1])&&(s=g,n=n.replace(s,""))}else if(a.test(n)){var T=a.exec(n);i=T[1],a=d,a.test(i)&&(n=i,a=S,h=w,l=x,a.test(n)?n+="e":h.test(n)?(s=g,n=n.replace(s,"")):l.test(n)&&(n+="e"))}if(s=k,s.test(n)){var T=s.exec(n);i=T[1],n=i+"i"}if(s=b,s.test(n)){var T=s.exec(n);i=T[1],o=T[2],s=u,s.test(i)&&(n=i+t[o])}if(s=E,s.test(n)){var T=s.exec(n);i=T[1],o=T[2],s=u,s.test(i)&&(n=i+e[o])}if(s=_,a=F,s.test(n)){var T=s.exec(n);i=T[1],s=c,s.test(i)&&(n=i)}else if(a.test(n)){var T=a.exec(n);i=T[1]+T[2],a=c,a.test(i)&&(n=i)}if(s=O,s.test(n)){var T=s.exec(n);i=T[1],s=c,a=f,h=N,(s.test(i)||a.test(i)&&!h.test(i))&&(n=i)}return s=P,a=c,s.test(n)&&a.test(n)&&(s=g,n=n.replace(s,"")),"y"==r&&(n=r.toLowerCase()+n.substr(1)),n};return T}(),t.Pipeline.registerFunction(t.stemmer,"stemmer"),t.stopWordFilter=function(e){return e&&t.stopWordFilter.stopWords[e]!==e?e:void 0},t.stopWordFilter.stopWords={a:"a",able:"able",about:"about",across:"across",after:"after",all:"all",almost:"almost",also:"also",am:"am",among:"among",an:"an",and:"and",any:"any",are:"are",as:"as",at:"at",be:"be",because:"because",been:"been",but:"but",by:"by",can:"can",cannot:"cannot",could:"could",dear:"dear",did:"did","do":"do",does:"does",either:"either","else":"else",ever:"ever",every:"every","for":"for",from:"from",get:"get",got:"got",had:"had",has:"has",have:"have",he:"he",her:"her",hers:"hers",him:"him",his:"his",how:"how",however:"however",i:"i","if":"if","in":"in",into:"into",is:"is",it:"it",its:"its",just:"just",least:"least",let:"let",like:"like",likely:"likely",may:"may",me:"me",might:"might",most:"most",must:"must",my:"my",neither:"neither",no:"no",nor:"nor",not:"not",of:"of",off:"off",often:"often",on:"on",only:"only",or:"or",other:"other",our:"our",own:"own",rather:"rather",said:"said",say:"say",says:"says",she:"she",should:"should",since:"since",so:"so",some:"some",than:"than",that:"that",the:"the",their:"their",them:"them",then:"then",there:"there",these:"these",they:"they","this":"this",tis:"tis",to:"to",too:"too",twas:"twas",us:"us",wants:"wants",was:"was",we:"we",were:"were",what:"what",when:"when",where:"where",which:"which","while":"while",who:"who",whom:"whom",why:"why",will:"will","with":"with",would:"would",yet:"yet",you:"you",your:"your"},t.Pipeline.registerFunction(t.stopWordFilter,"stopWordFilter"),t.trimmer=function(t){var e=t.replace(/^\W+/,"").replace(/\W+$/,"");return""===e?void 0:e},t.Pipeline.registerFunction(t.trimmer,"trimmer"),t.TokenStore=function(){this.root={docs:{}},this.length=0},t.TokenStore.load=function(t){var e=new this;return e.root=t.root,e.length=t.length,e},t.TokenStore.prototype.add=function(t,e,n){var n=n||this.root,i=t[0],o=t.slice(1);return i in n||(n[i]={docs:{}}),0===o.length?(n[i].docs[e.ref]=e,void(this.length+=1)):this.add(o,e,n[i])},t.TokenStore.prototype.has=function(t){if(!t)return!1;for(var e=this.root,n=0;n<t.length;n++){if(!e[t[n]])return!1;e=e[t[n]]}return!0},t.TokenStore.prototype.getNode=function(t){if(!t)return{};for(var e=this.root,n=0;n<t.length;n++){if(!e[t[n]])return{};e=e[t[n]]}return e},t.TokenStore.prototype.get=function(t,e){return this.getNode(t,e).docs||{}},t.TokenStore.prototype.count=function(t,e){return Object.keys(this.get(t,e)).length},t.TokenStore.prototype.remove=function(t,e){if(t){for(var n=this.root,i=0;i<t.length;i++){if(!(t[i]in n))return;n=n[t[i]]}delete n.docs[e]}},t.TokenStore.prototype.expand=function(t,e){var n=this.getNode(t),i=n.docs||{},e=e||[];return Object.keys(i).length&&e.push(t),Object.keys(n).forEach(function(n){"docs"!==n&&e.concat(this.expand(t+n,e))},this),e},t.TokenStore.prototype.toJSON=function(){return{root:this.root,length:this.length}},function(t,e){"function"==typeof define&&define.amd?define(e):"object"==typeof exports?module.exports=e():t.lunr=e()}(this,function(){return t})}();
8 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-bookdown.js:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | gitbook.require(["gitbook", "lodash", "jQuery"], function(gitbook, _, $) {
  2 | 
  3 |   var gs = gitbook.storage;
  4 | 
  5 |   gitbook.events.bind("start", function(e, config) {
  6 | 
  7 |     // add the Edit button (edit on Github)
  8 |     var edit = config.edit;
  9 |     if (edit && edit.link) gitbook.toolbar.createButton({
 10 |       icon: 'fa fa-edit',
 11 |       label: edit.text || 'Edit',
 12 |       position: 'left',
 13 |       onClick: function(e) {
 14 |         e.preventDefault();
 15 |         window.open(edit.link);
 16 |       }
 17 |     });
 18 | 
 19 |     var down = config.download;
 20 |     var normalizeDownload = function() {
 21 |       if (!down || !(down instanceof Array) || down.length === 0) return;
 22 |       if (down[0] instanceof Array) return down;
 23 |       return $.map(down, function(file, i) {
 24 |         return [[file, file.replace(/.*[.]/g, '').toUpperCase()]];
 25 |       });
 26 |     };
 27 |     down = normalizeDownload(down);
 28 |     if (down) if (down.length === 1 && /[.]pdf$/.test(down[0][0])) {
 29 |       gitbook.toolbar.createButton({
 30 |         icon: 'fa fa-file-pdf-o',
 31 |         label: down[0][1],
 32 |         position: 'left',
 33 |         onClick: function(e) {
 34 |           e.preventDefault();
 35 |           window.open(down[0][0]);
 36 |         }
 37 |       });
 38 |     } else {
 39 |       gitbook.toolbar.createButton({
 40 |         icon: 'fa fa-download',
 41 |         label: 'Download',
 42 |         position: 'left',
 43 |         dropdown: $.map(down, function(item, i) {
 44 |           return {
 45 |             text: item[1],
 46 |             onClick: function(e) {
 47 |               e.preventDefault();
 48 |               window.open(item[0]);
 49 |             }
 50 |           };
 51 |         })
 52 |       });
 53 |     }
 54 | 
 55 |     // highlight the current section in TOC
 56 |     var href = window.location.pathname;
 57 |     href = href.substr(href.lastIndexOf('/') + 1);
 58 |     if (href === '') href = 'index.html';
 59 |     var li = $('a[href^="' + href + location.hash + '"]').parent('li.chapter').first();
 60 |     var summary = $('ul.summary'), chaps = summary.find('li.chapter');
 61 |     if (li.length === 0) li = chaps.first();
 62 |     li.addClass('active');
 63 |     chaps.on('click', function(e) {
 64 |       chaps.removeClass('active');
 65 |       $(this).addClass('active');
 66 |       gs.set('tocScrollTop', summary.scrollTop());
 67 |     });
 68 | 
 69 |     var toc = config.toc;
 70 |     // collapse TOC items that are not for the current chapter
 71 |     if (toc && toc.collapse) (function() {
 72 |       var type = toc.collapse;
 73 |       if (type === 'none') return;
 74 |       if (type !== 'section' && type !== 'subsection') return;
 75 |       // sections under chapters
 76 |       var toc_sub = summary.children('li[data-level]').children('ul');
 77 |       if (type === 'section') {
 78 |         toc_sub.hide()
 79 |           .parent().has(li).children('ul').show();
 80 |       } else {
 81 |         toc_sub.children('li').children('ul').hide()
 82 |           .parent().has(li).children('ul').show();
 83 |       }
 84 |       li.children('ul').show();
 85 |       var toc_sub2 = toc_sub.children('li');
 86 |       if (type === 'section') toc_sub2.children('ul').hide();
 87 |       summary.children('li[data-level]').find('a')
 88 |         .on('click.bookdown', function(e) {
 89 |           if (href === $(this).attr('href').replace(/#.*/, ''))
 90 |             $(this).parent('li').children('ul').toggle();
 91 |         });
 92 |     })();
 93 | 
 94 |     // add tooltips to the <a>'s that are truncated
 95 |     $('a').each(function(i, el) {
 96 |       if (el.offsetWidth >= el.scrollWidth) return;
 97 |       if (typeof el.title === 'undefined') return;
 98 |       el.title = el.text;
 99 |     });
100 | 
101 |     // restore TOC scroll position
102 |     var pos = gs.get('tocScrollTop');
103 |     if (typeof pos !== 'undefined') summary.scrollTop(pos);
104 | 
105 |     // highlight the TOC item that has same text as the heading in view as scrolling
106 |     if (toc && toc.scroll_highlight !== false) (function() {
107 |       // scroll the current TOC item into viewport
108 |       var ht = $(window).height(), rect = li[0].getBoundingClientRect();
109 |       if (rect.top >= ht || rect.top <= 0 || rect.bottom <= 0) {
110 |         summary.scrollTop(li[0].offsetTop);
111 |       }
112 |       // current chapter TOC items
113 |       var items = $('a[href^="' + href + '"]').parent('li.chapter'),
114 |           m = items.length;
115 |       if (m === 0) {
116 |         items = summary.find('li.chapter');
117 |         m = items.length;
118 |       }
119 |       if (m === 0) return;
120 |       // all section titles on current page
121 |       var hs = bookInner.find('.page-inner').find('h1,h2,h3'), n = hs.length,
122 |           ts = hs.map(function(i, el) { return $(el).text(); });
123 |       if (n === 0) return;
124 |       var scrollHandler = function(e) {
125 |         var ht = $(window).height();
126 |         clearTimeout($.data(this, 'scrollTimer'));
127 |         $.data(this, 'scrollTimer', setTimeout(function() {
128 |           // find the first visible title in the viewport
129 |           for (var i = 0; i < n; i++) {
130 |             var rect = hs[i].getBoundingClientRect();
131 |             if (rect.top >= 0 && rect.bottom <= ht) break;
132 |           }
133 |           if (i === n) return;
134 |           items.removeClass('active');
135 |           for (var j = 0; j < m; j++) {
136 |             if (items.eq(j).children('a').first().text() === ts[i]) break;
137 |           }
138 |           if (j === m) j = 0;  // highlight the chapter title
139 |           // search bottom-up for a visible TOC item to highlight; if an item is
140 |           // hidden, we check if its parent is visible, and so on
141 |           while (j > 0 && items.eq(j).is(':hidden')) j--;
142 |           items.eq(j).addClass('active');
143 |         }, 250));
144 |       };
145 |       bookInner.on('scroll.bookdown', scrollHandler);
146 |       bookBody.on('scroll.bookdown', scrollHandler);
147 |     })();
148 | 
149 |     // do not refresh the page if the TOC item points to the current page
150 |     $('a[href="' + href + '"]').parent('li.chapter').children('a')
151 |       .on('click', function(e) {
152 |         bookInner.scrollTop(0);
153 |         bookBody.scrollTop(0);
154 |         return false;
155 |       });
156 | 
157 |     var toolbar = config.toolbar;
158 |     if (!toolbar || toolbar.position !== 'static') {
159 |       var bookHeader = $('.book-header');
160 |       bookBody.addClass('fixed');
161 |       bookHeader.addClass('fixed')
162 |       .css('background-color', bookBody.css('background-color'))
163 |       .on('click.bookdown', function(e) {
164 |         // the theme may have changed after user clicks the theme button
165 |         bookHeader.css('background-color', bookBody.css('background-color'));
166 |       });
167 |     }
168 | 
169 |   });
170 | 
171 |   gitbook.events.bind("page.change", function(e) {
172 |     // store TOC scroll position
173 |     var summary = $('ul.summary');
174 |     gs.set('tocScrollTop', summary.scrollTop());
175 |   });
176 | 
177 |   var bookBody = $('.book-body'), bookInner = bookBody.find('.body-inner');
178 |   var chapterTitle = function() {
179 |     return bookInner.find('.page-inner').find('h1,h2').first().text();
180 |   };
181 |   var bookTitle = function() {
182 |     return bookInner.find('.book-header > h1').first().text();
183 |   };
184 |   var saveScrollPos = function(e) {
185 |     // save scroll position before page is reloaded
186 |     gs.set('bodyScrollTop', {
187 |       body: bookBody.scrollTop(),
188 |       inner: bookInner.scrollTop(),
189 |       focused: document.hasFocus(),
190 |       title: chapterTitle()
191 |     });
192 |   };
193 |   $(document).on('servr:reload', saveScrollPos);
194 | 
195 |   // check if the page is loaded in an iframe (e.g. the RStudio preview window)
196 |   var inIFrame = function() {
197 |     var inIframe = true;
198 |     try { inIframe = window.self !== window.top; } catch (e) {}
199 |     return inIframe;
200 |   };
201 |   $(window).on('blur unload', function(e) {
202 |     if (inIFrame()) saveScrollPos(e);
203 |     gs.set('bookTitle', bookTitle());
204 |   });
205 | 
206 |   $(function(e) {
207 |     if (gs.get('bookTitle', '') !== bookTitle()) localStorage.clear();
208 |     var pos = gs.get('bodyScrollTop');
209 |     if (pos) {
210 |       if (pos.title === chapterTitle()) {
211 |         if (pos.body !== 0) bookBody.scrollTop(pos.body);
212 |         if (pos.inner !== 0) bookInner.scrollTop(pos.inner);
213 |       }
214 |       if (pos.focused) bookInner.find('.page-wrapper').focus();
215 |     }
216 |     // clear book body scroll position
217 |     gs.remove('bodyScrollTop');
218 |   });
219 | 
220 | });
221 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-fontsettings.js:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | gitbook.require(["gitbook", "lodash", "jQuery"], function(gitbook, _, $) {
  2 |     var fontState;
  3 | 
  4 |     var THEMES = {
  5 |         "white": 0,
  6 |         "sepia": 1,
  7 |         "night": 2
  8 |     };
  9 | 
 10 |     var FAMILY = {
 11 |         "serif": 0,
 12 |         "sans": 1
 13 |     };
 14 | 
 15 |     // Save current font settings
 16 |     function saveFontSettings() {
 17 |         gitbook.storage.set("fontState", fontState);
 18 |         update();
 19 |     }
 20 | 
 21 |     // Increase font size
 22 |     function enlargeFontSize(e) {
 23 |         e.preventDefault();
 24 |         if (fontState.size >= 4) return;
 25 | 
 26 |         fontState.size++;
 27 |         saveFontSettings();
 28 |     };
 29 | 
 30 |     // Decrease font size
 31 |     function reduceFontSize(e) {
 32 |         e.preventDefault();
 33 |         if (fontState.size <= 0) return;
 34 | 
 35 |         fontState.size--;
 36 |         saveFontSettings();
 37 |     };
 38 | 
 39 |     // Change font family
 40 |     function changeFontFamily(index, e) {
 41 |         e.preventDefault();
 42 | 
 43 |         fontState.family = index;
 44 |         saveFontSettings();
 45 |     };
 46 | 
 47 |     // Change type of color
 48 |     function changeColorTheme(index, e) {
 49 |         e.preventDefault();
 50 | 
 51 |         var $book = $(".book");
 52 | 
 53 |         if (fontState.theme !== 0)
 54 |             $book.removeClass("color-theme-"+fontState.theme);
 55 | 
 56 |         fontState.theme = index;
 57 |         if (fontState.theme !== 0)
 58 |             $book.addClass("color-theme-"+fontState.theme);
 59 | 
 60 |         saveFontSettings();
 61 |     };
 62 | 
 63 |     function update() {
 64 |         var $book = gitbook.state.$book;
 65 | 
 66 |         $(".font-settings .font-family-list li").removeClass("active");
 67 |         $(".font-settings .font-family-list li:nth-child("+(fontState.family+1)+")").addClass("active");
 68 | 
 69 |         $book[0].className = $book[0].className.replace(/\bfont-\S+/g, '');
 70 |         $book.addClass("font-size-"+fontState.size);
 71 |         $book.addClass("font-family-"+fontState.family);
 72 | 
 73 |         if(fontState.theme !== 0) {
 74 |             $book[0].className = $book[0].className.replace(/\bcolor-theme-\S+/g, '');
 75 |             $book.addClass("color-theme-"+fontState.theme);
 76 |         }
 77 |     };
 78 | 
 79 |     function init(config) {
 80 |         var $bookBody, $book;
 81 | 
 82 |         //Find DOM elements.
 83 |         $book = gitbook.state.$book;
 84 |         $bookBody = $book.find(".book-body");
 85 | 
 86 |         // Instantiate font state object
 87 |         fontState = gitbook.storage.get("fontState", {
 88 |             size: config.size || 2,
 89 |             family: FAMILY[config.family || "sans"],
 90 |             theme: THEMES[config.theme || "white"]
 91 |         });
 92 | 
 93 |         update();
 94 |     };
 95 | 
 96 | 
 97 |     gitbook.events.bind("start", function(e, config) {
 98 |         var opts = config.fontsettings;
 99 | 
100 |         // Create buttons in toolbar
101 |         gitbook.toolbar.createButton({
102 |             icon: 'fa fa-font',
103 |             label: 'Font Settings',
104 |             className: 'font-settings',
105 |             dropdown: [
106 |                 [
107 |                     {
108 |                         text: 'A',
109 |                         className: 'font-reduce',
110 |                         onClick: reduceFontSize
111 |                     },
112 |                     {
113 |                         text: 'A',
114 |                         className: 'font-enlarge',
115 |                         onClick: enlargeFontSize
116 |                     }
117 |                 ],
118 |                 [
119 |                     {
120 |                         text: 'Serif',
121 |                         onClick: _.partial(changeFontFamily, 0)
122 |                     },
123 |                     {
124 |                         text: 'Sans',
125 |                         onClick: _.partial(changeFontFamily, 1)
126 |                     }
127 |                 ],
128 |                 [
129 |                     {
130 |                         text: 'White',
131 |                         onClick: _.partial(changeColorTheme, 0)
132 |                     },
133 |                     {
134 |                         text: 'Sepia',
135 |                         onClick: _.partial(changeColorTheme, 1)
136 |                     },
137 |                     {
138 |                         text: 'Night',
139 |                         onClick: _.partial(changeColorTheme, 2)
140 |                     }
141 |                 ]
142 |             ]
143 |         });
144 | 
145 | 
146 |         // Init current settings
147 |         init(opts);
148 |     });
149 | });
150 | 
151 | 
152 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-search.js:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | gitbook.require(["gitbook", "lodash", "jQuery"], function(gitbook, _, $) {
  2 |     var index = null;
  3 |     var $searchInput, $searchForm;
  4 |     var $highlighted, hi = 0, hiOpts = { className: 'search-highlight' };
  5 |     var collapse = false;
  6 | 
  7 |     // Use a specific index
  8 |     function loadIndex(data) {
  9 |         // [Yihui] In bookdown, I use a character matrix to store the chapter
 10 |         // content, and the index is dynamically built on the client side.
 11 |         // Gitbook prebuilds the index data instead: https://github.com/GitbookIO/plugin-search
 12 |         // We can certainly do that via R packages V8 and jsonlite, but let's
 13 |         // see how slow it really is before improving it. On the other hand,
 14 |         // lunr cannot handle non-English text very well, e.g. the default
 15 |         // tokenizer cannot deal with Chinese text, so we may want to replace
 16 |         // lunr with a dumb simple text matching approach.
 17 |         index = lunr(function () {
 18 |           this.ref('url');
 19 |           this.field('title', { boost: 10 });
 20 |           this.field('body');
 21 |         });
 22 |         data.map(function(item) {
 23 |           index.add({
 24 |             url: item[0],
 25 |             title: item[1],
 26 |             body: item[2]
 27 |           });
 28 |         });
 29 |     }
 30 | 
 31 |     // Fetch the search index
 32 |     function fetchIndex() {
 33 |         return $.getJSON(gitbook.state.basePath+"/search_index.json")
 34 |                 .then(loadIndex);  // [Yihui] we need to use this object later
 35 |     }
 36 | 
 37 |     // Search for a term and return results
 38 |     function search(q) {
 39 |         if (!index) return;
 40 | 
 41 |         var results = _.chain(index.search(q))
 42 |         .map(function(result) {
 43 |             var parts = result.ref.split("#");
 44 |             return {
 45 |                 path: parts[0],
 46 |                 hash: parts[1]
 47 |             };
 48 |         })
 49 |         .value();
 50 | 
 51 |         // [Yihui] Highlight the search keyword on current page
 52 |         hi = 0;
 53 |         $highlighted = results.length === 0 ? undefined : $('.page-inner')
 54 |           .unhighlight(hiOpts).highlight(q, hiOpts).find('span.search-highlight');
 55 |         scrollToHighlighted();
 56 |         toggleTOC(results.length > 0);
 57 | 
 58 |         return results;
 59 |     }
 60 | 
 61 |     // [Yihui] Scroll the chapter body to the i-th highlighted string
 62 |     function scrollToHighlighted() {
 63 |       if (!$highlighted) return;
 64 |       var n = $highlighted.length;
 65 |       if (n === 0) return;
 66 |       var $p = $highlighted.eq(hi), p = $p[0], rect = p.getBoundingClientRect();
 67 |       if (rect.top < 0 || rect.bottom > $(window).height()) {
 68 |         ($(window).width() >= 1240 ? $('.body-inner') : $('.book-body'))
 69 |           .scrollTop(p.offsetTop - 100);
 70 |       }
 71 |       $highlighted.css('background-color', '');
 72 |       // an orange background color on the current item and removed later
 73 |       $p.css('background-color', 'orange');
 74 |       setTimeout(function() {
 75 |         $p.css('background-color', '');
 76 |       }, 2000);
 77 |     }
 78 | 
 79 |     // [Yihui] Expand/collapse TOC
 80 |     function toggleTOC(show) {
 81 |       if (!collapse) return;
 82 |       var toc_sub = $('ul.summary').children('li[data-level]').children('ul');
 83 |       if (show) return toc_sub.show();
 84 |       var href = window.location.pathname;
 85 |       href = href.substr(href.lastIndexOf('/') + 1);
 86 |       if (href === '') href = 'index.html';
 87 |       var li = $('a[href^="' + href + location.hash + '"]').parent('li.chapter').first();
 88 |       toc_sub.hide().parent().has(li).children('ul').show();
 89 |       li.children('ul').show();
 90 |     }
 91 | 
 92 |     // Create search form
 93 |     function createForm(value) {
 94 |         if ($searchForm) $searchForm.remove();
 95 |         if ($searchInput) $searchInput.remove();
 96 | 
 97 |         $searchForm = $('<div>', {
 98 |             'class': 'book-search',
 99 |             'role': 'search'
100 |         });
101 | 
102 |         $searchInput = $('<input>', {
103 |             'type': 'search',
104 |             'class': 'form-control',
105 |             'val': value,
106 |             'placeholder': 'Type to search'
107 |         });
108 | 
109 |         $searchInput.appendTo($searchForm);
110 |         $searchForm.prependTo(gitbook.state.$book.find('.book-summary'));
111 |     }
112 | 
113 |     // Return true if search is open
114 |     function isSearchOpen() {
115 |         return gitbook.state.$book.hasClass("with-search");
116 |     }
117 | 
118 |     // Toggle the search
119 |     function toggleSearch(_state) {
120 |         if (isSearchOpen() === _state) return;
121 |         if (!$searchInput) return;
122 | 
123 |         gitbook.state.$book.toggleClass("with-search", _state);
124 | 
125 |         // If search bar is open: focus input
126 |         if (isSearchOpen()) {
127 |             gitbook.sidebar.toggle(true);
128 |             $searchInput.focus();
129 |         } else {
130 |             $searchInput.blur();
131 |             $searchInput.val("");
132 |             gitbook.storage.remove("keyword");
133 |             gitbook.sidebar.filter(null);
134 |             $('.page-inner').unhighlight(hiOpts);
135 |             toggleTOC(false);
136 |         }
137 |     }
138 | 
139 |     // Recover current search when page changed
140 |     function recoverSearch() {
141 |         var keyword = gitbook.storage.get("keyword", "");
142 | 
143 |         createForm(keyword);
144 | 
145 |         if (keyword.length > 0) {
146 |             if(!isSearchOpen()) {
147 |                 toggleSearch(true); // [Yihui] open the search box
148 |             }
149 |             gitbook.sidebar.filter(_.pluck(search(keyword), "path"));
150 |         }
151 |     }
152 | 
153 | 
154 |     gitbook.events.bind("start", function(e, config) {
155 |         // [Yihui] disable search
156 |         if (config.search === false) return;
157 |         collapse = !config.toc || config.toc.collapse === 'section' ||
158 |           config.toc.collapse === 'subsection';
159 | 
160 |         // Pre-fetch search index and create the form
161 |         fetchIndex()
162 |         // [Yihui] recover search after the page is loaded
163 |         .then(recoverSearch);
164 | 
165 | 
166 |         // Type in search bar
167 |         $(document).on("keyup", ".book-search input", function(e) {
168 |             var key = (e.keyCode ? e.keyCode : e.which);
169 |             // [Yihui] Escape -> close search box; Up/Down: previous/next highlighted
170 |             if (key == 27) {
171 |                 e.preventDefault();
172 |                 toggleSearch(false);
173 |             } else if (key == 38) {
174 |               if (hi <= 0 && $highlighted) hi = $highlighted.length;
175 |               hi--;
176 |               scrollToHighlighted();
177 |             } else if (key == 40) {
178 |               hi++;
179 |               if ($highlighted && hi >= $highlighted.length) hi = 0;
180 |               scrollToHighlighted();
181 |             }
182 |         }).on("input", ".book-search input", function(e) {
183 |             var q = $(this).val().trim();
184 |             if (q.length === 0) {
185 |                 gitbook.sidebar.filter(null);
186 |                 gitbook.storage.remove("keyword");
187 |                 $('.page-inner').unhighlight(hiOpts);
188 |                 toggleTOC(false);
189 |             } else {
190 |                 var results = search(q);
191 |                 gitbook.sidebar.filter(
192 |                     _.pluck(results, "path")
193 |                 );
194 |                 gitbook.storage.set("keyword", q);
195 |             }
196 |         });
197 | 
198 |         // Create the toggle search button
199 |         gitbook.toolbar.createButton({
200 |             icon: 'fa fa-search',
201 |             label: 'Search',
202 |             position: 'left',
203 |             onClick: toggleSearch
204 |         });
205 | 
206 |         // Bind keyboard to toggle search
207 |         gitbook.keyboard.bind(['f'], toggleSearch);
208 |     });
209 | 
210 |     // [Yihui] do not try to recover search; always start fresh
211 |     // gitbook.events.bind("page.change", recoverSearch);
212 | });
213 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/libs/gitbook-2.6.7/js/plugin-sharing.js:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | gitbook.require(["gitbook", "lodash", "jQuery"], function(gitbook, _, $) {
  2 |     var SITES = {
  3 |         'github': {
  4 |             'label': 'Github',
  5 |             'icon': 'fa fa-github',
  6 |             'onClick': function(e) {
  7 |                 e.preventDefault();
  8 |                 var repo = $('meta[name="github-repo"]').attr('content');
  9 |                 if (typeof repo === 'undefined') throw("Github repo not defined");
 10 |                 window.open("https://github.com/"+repo);
 11 |             }
 12 |         },
 13 |         'facebook': {
 14 |             'label': 'Facebook',
 15 |             'icon': 'fa fa-facebook',
 16 |             'onClick': function(e) {
 17 |                 e.preventDefault();
 18 |                 window.open("http://www.facebook.com/sharer/sharer.php?s=100&p[url]="+encodeURIComponent(location.href));
 19 |             }
 20 |         },
 21 |         'twitter': {
 22 |             'label': 'Twitter',
 23 |             'icon': 'fa fa-twitter',
 24 |             'onClick': function(e) {
 25 |                 e.preventDefault();
 26 |                 window.open("http://twitter.com/home?status="+encodeURIComponent(document.title+" "+location.href));
 27 |             }
 28 |         },
 29 |         'google': {
 30 |             'label': 'Google+',
 31 |             'icon': 'fa fa-google-plus',
 32 |             'onClick': function(e) {
 33 |                 e.preventDefault();
 34 |                 window.open("https://plus.google.com/share?url="+encodeURIComponent(location.href));
 35 |             }
 36 |         },
 37 |         'weibo': {
 38 |             'label': 'Weibo',
 39 |             'icon': 'fa fa-weibo',
 40 |             'onClick': function(e) {
 41 |                 e.preventDefault();
 42 |                 window.open("http://service.weibo.com/share/share.php?content=utf-8&url="+encodeURIComponent(location.href)+"&title="+encodeURIComponent(document.title));
 43 |             }
 44 |         },
 45 |         'instapaper': {
 46 |             'label': 'Instapaper',
 47 |             'icon': 'fa fa-instapaper',
 48 |             'onClick': function(e) {
 49 |                 e.preventDefault();
 50 |                 window.open("http://www.instapaper.com/text?u="+encodeURIComponent(location.href));
 51 |             }
 52 |         },
 53 |         'vk': {
 54 |             'label': 'VK',
 55 |             'icon': 'fa fa-vk',
 56 |             'onClick': function(e) {
 57 |                 e.preventDefault();
 58 |                 window.open("http://vkontakte.ru/share.php?url="+encodeURIComponent(location.href));
 59 |             }
 60 |         }
 61 |     };
 62 | 
 63 | 
 64 | 
 65 |     gitbook.events.bind("start", function(e, config) {
 66 |         var opts = config.sharing;
 67 |         if (!opts) return;
 68 | 
 69 |         // Create dropdown menu
 70 |         var menu = _.chain(opts.all)
 71 |             .map(function(id) {
 72 |                 var site = SITES[id];
 73 | 
 74 |                 return {
 75 |                     text: site.label,
 76 |                     onClick: site.onClick
 77 |                 };
 78 |             })
 79 |             .compact()
 80 |             .value();
 81 | 
 82 |         // Create main button with dropdown
 83 |         if (menu.length > 0) {
 84 |             gitbook.toolbar.createButton({
 85 |                 icon: 'fa fa-share-alt',
 86 |                 label: 'Share',
 87 |                 position: 'right',
 88 |                 dropdown: [menu]
 89 |             });
 90 |         }
 91 | 
 92 |         // Direct actions to share
 93 |         _.each(SITES, function(site, sideId) {
 94 |             if (!opts[sideId]) return;
 95 | 
 96 |             gitbook.toolbar.createButton({
 97 |                 icon: site.icon,
 98 |                 label: site.text,
 99 |                 position: 'right',
100 |                 onClick: site.onClick
101 |             });
102 |         });
103 |     });
104 | });
105 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/packages.bib:
--------------------------------------------------------------------------------
 1 | @Manual{R-base,
 2 |   title = {R: A Language and Environment for Statistical Computing},
 3 |   author = {{R Core Team}},
 4 |   organization = {R Foundation for Statistical Computing},
 5 |   address = {Vienna, Austria},
 6 |   year = {2016},
 7 |   url = {https://www.R-project.org/},
 8 | }
 9 | @Manual{R-bookdown,
10 |   title = {bookdown: Authoring Books and Technical Documents with R Markdown},
11 |   author = {Yihui Xie},
12 |   year = {2017},
13 |   note = {R package version 0.4},
14 |   url = {https://CRAN.R-project.org/package=bookdown},
15 | }
16 | @Manual{R-knitr,
17 |   title = {knitr: A General-Purpose Package for Dynamic Report Generation in R},
18 |   author = {Yihui Xie},
19 |   year = {2017},
20 |   note = {R package version 1.16},
21 |   url = {https://CRAN.R-project.org/package=knitr},
22 | }
23 | @Manual{R-rmarkdown,
24 |   title = {rmarkdown: Dynamic Documents for R},
25 |   author = {JJ Allaire and Joe Cheng and Yihui Xie and Jonathan McPherson and Winston Chang and Jeff Allen and Hadley Wickham and Aron Atkins and Rob Hyndman},
26 |   year = {2016},
27 |   note = {R package version 1.3},
28 |   url = {https://CRAN.R-project.org/package=rmarkdown},
29 | }
30 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/template.tex:
--------------------------------------------------------------------------------
  1 | \documentclass[$if(fontsize)$$fontsize$,$endif$$if(lang)$$babel-lang$,$endif$$if(papersize)$$papersize$paper,$endif$$for(classoption)$$classoption$$sep$,$endfor$]{$documentclass$}
  2 | $if(beamerarticle)$
  3 | \usepackage{beamerarticle} % needs to be loaded first
  4 | $endif$
  5 | $if(fontfamily)$
  6 | \usepackage[$for(fontfamilyoptions)$$fontfamilyoptions$$sep$,$endfor$]{$fontfamily$}
  7 | $else$
  8 | \usepackage{lmodern}
  9 | $endif$
 10 | $if(linestretch)$
 11 | \usepackage{setspace}
 12 | \setstretch{$linestretch$}
 13 | $endif$
 14 | \usepackage{amssymb,amsmath}
 15 | \usepackage{ifxetex,ifluatex}
 16 | \usepackage{fixltx2e} % provides \textsubscript
 17 | \ifnum 0\ifxetex 1\fi\ifluatex 1\fi=0 % if pdftex
 18 |   \usepackage[$if(fontenc)$$fontenc$$else$T1$endif$]{fontenc}
 19 |   \usepackage[utf8]{inputenc}
 20 | $if(euro)$
 21 |   \usepackage{eurosym}
 22 | $endif$
 23 | \else % if luatex or xelatex
 24 |   \ifxetex
 25 |     \usepackage{xltxtra,xunicode}
 26 |   \else
 27 |     \usepackage{fontspec}
 28 |   \fi
 29 |   \defaultfontfeatures{Ligatures=TeX,Scale=MatchLowercase}
 30 | $for(fontfamilies)$
 31 |   \newfontfamily{$fontfamilies.name$}[$fontfamilies.options$]{$fontfamilies.font$}
 32 | $endfor$
 33 | $if(euro)$
 34 |   \newcommand{\euro}{€}
 35 | $endif$
 36 | $if(mainfont)$
 37 |     \setmainfont[$for(mainfontoptions)$$mainfontoptions$$sep$,$endfor$]{$mainfont$}
 38 | $endif$
 39 | $if(sansfont)$
 40 |     \setsansfont[$for(sansfontoptions)$$sansfontoptions$$sep$,$endfor$]{$sansfont$}
 41 | $endif$
 42 | $if(monofont)$
 43 |     \setmonofont[Mapping=tex-ansi$if(monofontoptions)$,$for(monofontoptions)$$monofontoptions$$sep$,$endfor$$endif$]{$monofont$}
 44 | $endif$
 45 | $if(CJKmainfont)$
 46 |     \usepackage{xeCJK}
 47 |     \setCJKmainfont[$for(CJKoptions)$$CJKoptions$$sep$,$endfor$]{$CJKmainfont$}
 48 | $endif$
 49 | \fi
 50 | % use upquote if available, for straight quotes in verbatim environments
 51 | \IfFileExists{upquote.sty}{\usepackage{upquote}}{}
 52 | % use microtype if available
 53 | \IfFileExists{microtype.sty}{%
 54 | \usepackage{microtype}
 55 | \UseMicrotypeSet[protrusion]{basicmath} % disable protrusion for tt fonts
 56 | }{}
 57 | $if(geometry)$
 58 | \usepackage[$for(geometry)$$geometry$$sep$,$endfor$]{geometry}
 59 | $endif$
 60 | \usepackage[unicode=true]{hyperref}
 61 | $if(colorlinks)$
 62 | \PassOptionsToPackage{usenames,dvipsnames}{color} % color is loaded by hyperref
 63 | $endif$
 64 | \hypersetup{
 65 | $if(title-meta)$
 66 |             pdftitle={$title-meta$},
 67 | $endif$
 68 | $if(author-meta)$
 69 |             pdfauthor={$author-meta$},
 70 | $endif$
 71 | $if(keywords)$
 72 |             pdfkeywords={$for(keywords)$$keywords$$sep$, $endfor$},
 73 | $endif$
 74 | $if(colorlinks)$
 75 |             colorlinks=true,
 76 |             linkcolor=$if(linkcolor)$$linkcolor$$else$Maroon$endif$,
 77 |             citecolor=$if(citecolor)$$citecolor$$else$Blue$endif$,
 78 |             urlcolor=$if(urlcolor)$$urlcolor$$else$Blue$endif$,
 79 | $else$
 80 |             pdfborder={0 0 0},
 81 | $endif$
 82 |             breaklinks=true}
 83 | \urlstyle{same}  % don't use monospace font for urls
 84 | $if(lang)$
 85 | \ifnum 0\ifxetex 1\fi\ifluatex 1\fi=0 % if pdftex
 86 |   \usepackage[shorthands=off,$for(babel-otherlangs)$$babel-otherlangs$,$endfor$main=$babel-lang$]{babel}
 87 | $if(babel-newcommands)$
 88 |   $babel-newcommands$
 89 | $endif$
 90 | \else
 91 |   \usepackage{polyglossia}
 92 |   \setmainlanguage[$polyglossia-lang.options$]{$polyglossia-lang.name$}
 93 | $for(polyglossia-otherlangs)$
 94 |   \setotherlanguage[$polyglossia-otherlangs.options$]{$polyglossia-otherlangs.name$}
 95 | $endfor$
 96 | \fi
 97 | $endif$
 98 | $if(natbib)$
 99 | \usepackage{natbib}
100 | \bibliographystyle{$if(biblio-style)$$biblio-style$$else$plainnat$endif$}
101 | $endif$
102 | $if(biblatex)$
103 | \usepackage[$if(biblio-style)$style=$biblio-style$,$endif$$for(biblatexoptions)$$biblatexoptions$$sep$,$endfor$]{biblatex}
104 | $for(bibliography)$
105 | \addbibresource{$bibliography$}
106 | $endfor$
107 | $endif$
108 | $if(listings)$
109 | \usepackage{listings}
110 | $endif$
111 | $if(lhs)$
112 | \lstnewenvironment{code}{\lstset{language=Haskell,basicstyle=\small\ttfamily}}{}
113 | $endif$
114 | $if(highlighting-macros)$
115 | $highlighting-macros$
116 | $endif$
117 | $if(verbatim-in-note)$
118 | \usepackage{fancyvrb}
119 | \VerbatimFootnotes % allows verbatim text in footnotes
120 | $endif$
121 | $if(tables)$
122 | \usepackage{longtable,booktabs}
123 | % Fix footnotes in tables (requires footnote package)
124 | \IfFileExists{footnote.sty}{\usepackage{footnote}\makesavenoteenv{long table}}{}
125 | $endif$
126 | $if(graphics)$
127 | \usepackage{graphicx,grffile}
128 | \makeatletter
129 | \def\maxwidth{\ifdim\Gin@nat@width>\linewidth\linewidth\else\Gin@nat@width\fi}
130 | \def\maxheight{\ifdim\Gin@nat@height>\textheight\textheight\else\Gin@nat@height\fi}
131 | \makeatother
132 | % Scale images if necessary, so that they will not overflow the page
133 | % margins by default, and it is still possible to overwrite the defaults
134 | % using explicit options in \includegraphics[width, height, ...]{}
135 | \setkeys{Gin}{width=\maxwidth,height=\maxheight,keepaspectratio}
136 | $endif$
137 | $if(links-as-notes)$
138 | % Make links footnotes instead of hotlinks:
139 | \renewcommand{\href}[2]{#2\footnote{\url{#1}}}
140 | $endif$
141 | $if(strikeout)$
142 | \usepackage[normalem]{ulem}
143 | % avoid problems with \sout in headers with hyperref:
144 | \pdfstringdefDisableCommands{\renewcommand{\sout}{}}
145 | $endif$
146 | $if(indent)$
147 | $else$
148 | \IfFileExists{parskip.sty}{%
149 | \usepackage{parskip}
150 | }{% else
151 | \setlength{\parindent}{0pt}
152 | \setlength{\parskip}{6pt plus 2pt minus 1pt}
153 | }
154 | $endif$
155 | \setlength{\emergencystretch}{3em}  % prevent overfull lines
156 | \providecommand{\tightlist}{%
157 |   \setlength{\itemsep}{0pt}\setlength{\parskip}{0pt}}
158 | $if(numbersections)$
159 | \setcounter{secnumdepth}{$if(secnumdepth)$$secnumdepth$$else$5$endif$}
160 | $else$
161 | \setcounter{secnumdepth}{0}
162 | $endif$
163 | $if(subparagraph)$
164 | $else$
165 | % Redefines (sub)paragraphs to behave more like sections
166 | \ifx\paragraph\undefined\else
167 | \let\oldparagraph\paragraph
168 | \renewcommand{\paragraph}[1]{\oldparagraph{#1}\mbox{}}
169 | \fi
170 | \ifx\subparagraph\undefined\else
171 | \let\oldsubparagraph\subparagraph
172 | \renewcommand{\subparagraph}[1]{\oldsubparagraph{#1}\mbox{}}
173 | \fi
174 | $endif$
175 | $if(dir)$
176 | \ifxetex
177 |   % load bidi as late as possible as it modifies e.g. graphicx
178 |   $if(latex-dir-rtl)$
179 |   \usepackage[RTLdocument]{bidi}
180 |   $else$
181 |   \usepackage{bidi}
182 |   $endif$
183 | \fi
184 | \ifnum 0\ifxetex 1\fi\ifluatex 1\fi=0 % if pdftex
185 |   \TeXXeTstate=1
186 |   \newcommand{\RL}[1]{\beginR #1\endR}
187 |   \newcommand{\LR}[1]{\beginL #1\endL}
188 |   \newenvironment{RTL}{\beginR}{\endR}
189 |   \newenvironment{LTR}{\beginL}{\endL}
190 | \fi
191 | $endif$
192 | 
193 | % set default figure placement to htbp
194 | \makeatletter
195 | \def\fps@figure{htbp}
196 | \makeatother
197 | 
198 | $for(header-includes)$
199 | $header-includes$
200 | $endfor$
201 | 
202 | $if(title)$
203 | \title{$title$$if(thanks)$\thanks{$thanks$}$endif$}
204 | $endif$
205 | $if(subtitle)$
206 | \providecommand{\subtitle}[1]{}
207 | \subtitle{$subtitle$}
208 | $endif$
209 | $if(author)$
210 | \author{$for(author)$$author$$sep$ \and $endfor$}
211 | $endif$
212 | $if(institute)$
213 | \providecommand{\institute}[1]{}
214 | \institute{$for(institute)$$institute$$sep$ \and $endfor$}
215 | $endif$
216 | \date{$date$}
217 | 
218 | \begin{document}
219 | $if(title)$
220 | \maketitle
221 | $endif$
222 | $if(abstract)$
223 | \begin{abstract}
224 | $abstract$
225 | \end{abstract}
226 | $endif$
227 | 
228 | $for(include-before)$
229 | $include-before$
230 | 
231 | $endfor$
232 | $if(toc)$
233 | {
234 | \setcounter{tocdepth}{$toc-depth$}
235 | \tableofcontents
236 | }
237 | $endif$
238 | $if(lot)$
239 | \listoftables
240 | $endif$
241 | $if(lof)$
242 | \listoffigures
243 | $endif$
244 | $body$
245 | 
246 | $if(natbib)$
247 | $if(bibliography)$
248 | $if(biblio-title)$
249 | $if(book-class)$
250 | \renewcommand\bibname{$biblio-title$}
251 | $else$
252 | \renewcommand\refname{$biblio-title$}
253 | $endif$
254 | $endif$
255 | \bibliography{$for(bibliography)$$bibliography$$sep$,$endfor$}
256 | 
257 | $endif$
258 | $endif$
259 | $if(biblatex)$
260 | \printbibliography$if(biblio-title)$[title=$biblio-title$]$endif$
261 | 
262 | $endif$
263 | $for(include-after)$
264 | $include-after$
265 | 
266 | $endfor$
267 | \end{document}
268 | 


--------------------------------------------------------------------------------
/test.png:
--------------------------------------------------------------------------------
https://raw.githubusercontent.com/best-practices-in-bioinformatics/basic/66e82070a6af8d165c3681105e5e6213e0223967/test.png


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